雌激素對盆底功能障礙患者陰道壁成纖維細胞力學反應的影響研究

高麗紅

（山西省呂梁市人民醫(yī)院婦產科，山西 呂梁 033000）

盆底功能障礙是指因盆底支持組織退化、損傷及功能障礙所導致的一組疾病，包括壓力性尿失禁、盆腔臟器脫垂、性功能障礙等。有報道稱，我國女性盆底功能障礙的發(fā)病率高達40%～60%[1]。近年來的研究發(fā)現，生物力學與盆底功能障礙的發(fā)生發(fā)展密切相關。成纖維細胞是組成女性盆底支持系統(tǒng)的重要成分之一，其通過感知應力能調節(jié)相關基因的表達及蛋白質的合成，從而起到維持盆底結締組織結構與功能的作用[2]。本文主要是探討雌激素對盆底功能障礙患者陰道壁成纖維細胞力學反應的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2020年1月期間在我院進行手術治療的10例盆底功能障礙患者作為研究對象。其納入標準是：性別為女性；具有進行手術治療的指征；術前3個月內未應用過激素類藥物；自愿參與本研究。其排除標準是：合并有結締組織病或其他嚴重的婦科疾?。徊v資料缺失；存在認知功能障礙。這些患者的年齡為55～60歲，平均年齡為（57.25±5.14）歲；其中，子宮脫垂患者有6例，壓力性尿失禁患者有4例。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清，胰蛋白酶，免疫組化試劑盒，逆轉錄酶，TRIzol試劑，Oligo （dT）18引物、Flexercell4000細胞加載系統(tǒng)，DNA擴增儀，酶標儀，Alpha凝膠成像系統(tǒng)。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與鑒定 術后取患者的陰道壁組織塊進行細胞原代培養(yǎng)，細胞融合后傳代培養(yǎng)12代。制備細胞爬片，取原代培養(yǎng)后的細胞進行水浴加熱處理，修復抗原，并進行免疫染色。

1.2.3 應力刺激 將3～5代對數期成纖維細胞接種在培養(yǎng)板上，每孔含4 mL的培養(yǎng)基、5×104個成纖維細胞。當細胞達到融合狀態(tài)后，將其分為靜態(tài)組和應力組。對靜態(tài)組成纖維細胞不進行應力刺激處理，對應力組成纖維細胞加載外力進行應力刺激。應力刺激的條件是：正弦波，頻率為0.3 Hz，牽拉10%，時間為12 h。

1.2.4 雌激素干預實驗 卸載外力后，將應力組成纖維細胞分為空白對照組（空白組）、無水乙醇溶媒空白組（溶媒組）和雌激素干預組（雌激素組）。在溶媒組成纖維細胞中加入10-8mol/L的無水乙醇，在雌激素組成纖維細胞中加入10-8mol/L無水乙醇與17β-雌二醇配置成的溶液，對空白組不做處理。完成上述操作后，將各組成纖維細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.5 擴增反應 采用Trizol法提取各組成纖維細胞的總RNA，進行逆轉錄合成cDNA。反應條件：反應體系為20μL，65℃下反應5 min，42℃下反應60 min，70℃下反應5 min。之后進行擴增反應，反應條件：反應體系為25μL，95℃下反應2 min，95℃下反應40 s，52℃下反應40 s，72℃下反應60 s，循環(huán)30次，72℃下反應5 min。引物序列詳見表1。

表1 引物序列

1.3 觀察指標

觀察應力刺激下盆底功能障礙患者陰道壁成纖維細胞的形態(tài)改變。 比較靜態(tài)組成纖維細胞與應力組成纖維細胞中Col ⅠmRNA、MMP-1mRNA、Col ⅢmRNA、TIMP-1mRNA的表達水平。比較空白組、溶媒組、雌激素組成纖維細胞中Col ⅠmRNA、MMP-1mRNA、Col ⅢmRNA、TIMP-1mRNA的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 應力刺激下陰道壁成纖維細胞的形態(tài)改變

盆底功能障礙患者的陰道壁成纖維細胞在受到應力刺激前呈多角形或梭形排列，無明顯的方向性；受到應力刺激后，陰道壁成纖維細胞呈長梭形排列，排列較規(guī)則，且排列方向多垂直于應力方向。

2.2 靜態(tài)組成纖維細胞與應力組成纖維細胞中各指標表達水平的比較

與靜態(tài)組成纖維細胞相比，應力組成纖維細胞中ColⅠmRNA、MMP-1mRNA的表達水平均更高，Col ⅢmRNA、TIMP-1mRNA的表達水平均更低，P＜0.05。詳見表2。

表2 靜態(tài)組成纖維細胞與應力組成纖維細胞中各指標表達水平的比較（%，±s ）

表2 靜態(tài)組成纖維細胞與應力組成纖維細胞中各指標表達水平的比較（%，±s ）

組別 Col ⅠmRNA Col ⅢmRNAMMP-1mRNA TIMP-1mRNA靜態(tài)組（n=10）1.062±0.047 0.592±0.128 1.310±0.139 1.431±0.392應力組（n=10）1.252±0.059 0.103±0.017 1.655±0.197 1.035±0.061 t值 7.965 11.975 4.525 3.157 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.006

2.3 空白組、溶媒組、雌激素組成纖維細胞中各指標表達水平的比較

與空白組成纖維細胞及溶媒組成纖維細胞相比，雌激素組成纖維細胞中Col ⅠmRNA、Col ⅢmRNA、TIMP-1mRNA的表達水平均更高，MMP-1mRNA的表達水平更低，P＜0.05。詳見表3。

表3 空白組、溶媒組、雌激素組成纖維細胞中各指標表達水平的比較（%，±s ）

表3 空白組、溶媒組、雌激素組成纖維細胞中各指標表達水平的比較（%，±s ）

組別 Col ⅠmRNACol ⅢmRNAMMP-1mRNA TIMP-1mRNA空白組（n=10）1.239±0.023 0.210±0.062 1.505±0.117 1.139±0.046溶媒組（n=10）1.233±0.025 0.103±0.012 1.629±0.164 1.082±0.033雌激素（n=10）1.324±0.051 0.926±0.104 1.322±0.102 1.271±0.097 F值 3.097 9.005 4.124 3.765 P值 0.005 ＜0.001 ＜0.001 0.004

3 討論

女性的盆底處于不同程度的力學環(huán)境下，盆底結締組織中的成纖維細胞具有感應力，可將力學信號轉化為生化信號，能通過調節(jié)細胞外基質的成分來適應力學環(huán)境的改變，維持盆底結締組織功能和結構的平衡[3]。當女性的盆底結構發(fā)生力學改變后，可引起盆底功能障礙。本研究的結果顯示，在應力作用下，女性陰道壁成纖維細胞的形態(tài)發(fā)生改變，細胞由多角形或梭形排列變?yōu)殚L梭形排列，且排列方向多垂直于應力方向。女性盆底結締組織的特性受到細胞外基質的影響，細胞外基質中膠原代謝的變化會導致盆底結構的支持力發(fā)生改變，最終可引起盆底功能障礙。在應力刺激的作用下，女性陰道壁成纖維細胞成分（如膠原蛋白、纖維粘連蛋白等）的合成會發(fā)生改變。Col Ⅰ、Col Ⅲ是陰道壁成纖維細胞中主要的膠原類型，也是構成盆底結締組織細胞外基質的重要成分。Col Ⅰ的硬度大，可起到支持盆底結締組織的作用；Col Ⅲ的彈性大，可保證盆底結締組織的彈性，二者共同維持著盆底支持系統(tǒng)的彈性和韌性。Col Ⅰ、Col Ⅲ表達水平的變化會影響盆底結締組織的生物力學性質。MMP-1具有降解Col Ⅰ、Col Ⅲ的作用，而TIMP-1可與MMP-1結合，調節(jié)MMP-1對Col Ⅰ、ColⅢ的降解[4]。本研究的結果顯示，受到應力刺激可導致女性陰道壁成纖維細胞中Col ⅠmRNA、MMP-1mRNA的表達水平增加，使Col ⅢmRNA、TIMP-1mRNA的表達水平降低。這說明，受到應力刺激可改善女性陰道壁成纖維細胞的膠原代謝狀態(tài)，上調細胞外基質中Col Ⅰ的表達水平，下調Col Ⅲ的表達水平，使盆底結締組織的結構增強、基質重塑。雌激素屬于類固醇激素，可通過結合雌激素受體形成復合物，影響靶基因的轉錄，誘導膠原蛋白的更新，促進膠原蛋白的成熟，抑制膠原蛋白的降解[5]。本研究的結果顯示，與空白組成纖維細胞及溶媒組成纖維細胞相比，雌激素組成纖維細胞中Col ⅠmRNA、Col ⅢmRNA、TIMP-1mRNA的表達水平更高，MMP-1mRNA的表達水平更低，P＜0.05。這說明，采用雌激素進行干預能在一定程度上改善女性陰道壁成纖維細胞受力后的代謝狀態(tài)，促進膠原蛋白的合成，抑制膠原蛋白的降解，改變細胞外基質的成分，促進細胞重塑，改變陰道壁成纖維細胞對應力刺激的應答，這可能是雌激素改善盆底功能的重要機制之一。本研究也表明，雌激素對受力后陰道壁成纖維細胞的逆轉效果有限，并不能完全對抗應力刺激的作用。

綜上所述，盆底功能障礙患者的陰道壁成纖維細胞在應力刺激下可出現膠原代謝改變，用雌激素進行干預能在一定程度上改善陰道壁成纖維細胞膠原代謝的狀態(tài)，阻止盆底功能障礙的進展。陰道壁成纖維細胞對應力刺激的應答及膠原代謝的改變有望成為盆底功能障礙治療中的研究重點，而雌激素對盆底功能障礙的確切作用機制有待于進一步研究。