黃精貴 黃小娟 梅金鈺 黃鷗飛 李文仕
摘要:目的 探討中藥綠豆及其復(fù)方海爾福清千口服液對(duì)汞中毒小鼠于預(yù)效果的實(shí)驗(yàn)研究。方法 用小白鼠復(fù)制汞中毒動(dòng)物模型,然后用中藥灌胃干預(yù),測定各種指標(biāo).用氯化汞(HgCl2)注射小鼠腹腔染毒,2周,然后用綠豆水提取液及其復(fù)方海爾福清千口服液灌胃干預(yù)2周.測定染毒前后及干預(yù)后的血紅蛋白含量;實(shí)驗(yàn)結(jié)束,取血分離血清測定,處死小鼠,取大腦,制備10%勻漿待測.其余器官肝,腎,生殖器,用甲醛浸泡送病理研究(另文).結(jié)果下面按1綠豆組,2清千組,3模型組,4正常組,依次排列,血紅蛋白(Hb)含量,染毒前:各組間比較,F(xiàn)=1.605,p=0.203,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義。染毒后:依次排列146.28±19.40▲▲a164.39±13.95▲★a152.26±31.94▲▲c183.63±16.96★★各組間比較,F(xiàn)=6.369,p=0.001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義;中藥干預(yù)后,依次排列為121.61±13.53▲▲b137.52±15.41▲▲★b145.43±19.17▲▲★★b171.13±17.12★★中藥干預(yù)后:各組間比較,F(xiàn)=16.635,p=0.001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義;腦(chAT)活力,26.00±8.82★★69.91±35.52★▲78.98±24.89★▲122.42±45.36▲▲:F=8.853,P=0.001,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義;腦(GSH-PX)活力,142.89±23.38★★126.48±8.11▲113.75±15.82▲▲149.71±22.93★★差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義;腦超氧陰離子自由基()清除率%,汞中毒明顯下降;結(jié)論 綜合分析,汞中毒小鼠,血紅蛋白、體重、大腦部分與記憶相關(guān)的關(guān)鍵酶活力,均明顯下降;中藥干預(yù)后有一定恢復(fù),以海爾福清千口服液更顯著一些。
關(guān)鍵詞:汞中毒 ; 小鼠 ; 綠豆; 海爾福清千口服液 ; 干預(yù)
【中圖分類號(hào)】R995 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1673-9026(2021)08-014-02
汞在工業(yè)上有重要的用途,據(jù)報(bào)導(dǎo)統(tǒng)計(jì)有3000多種,但在工業(yè)生產(chǎn)過程中容易造成環(huán)境污染,是環(huán)境污染主要毒物之一。汞中毒損害機(jī)體重要器官,如腎臟,造血系統(tǒng),生殖系統(tǒng),神經(jīng)系統(tǒng),等[1]。本實(shí)驗(yàn)主要探討汞對(duì)記憶有關(guān)的關(guān)鍵酶活性的影響,以及中藥具有解毒作用的綠豆及其復(fù)方制劑對(duì)其干預(yù)治療作用的探討。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)導(dǎo)如下。
1. 試劑與方法:
1.1試劑. 乙酰膽堿酯酶(AchE)測試盒、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(chAT)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX),測試盒、甘油三酯、總膽固醇、尿素氮測定試劑盒、總蛋白測定試劑盒。1-奈胺、鹽酸羥胺、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸(HCL)、高鐵氰化鉀、氰化鉀、無水磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉,過硫酸銨, 氯化汞,均為國產(chǎn)分析純。
1.2中藥綠豆干品,購自市面,制取流程:稱取中藥放鍋內(nèi) 加自來水20倍加熱煮沸40分鐘過濾加熱濃縮冷卻 加3倍量v/v95%乙醇沉淀過夜過濾棄沉淀回收乙醇藥液定容裝瓶105℃高壓消毒30 分鐘 . 常溫,保存待用。復(fù)方海爾福清千口服液由廣西云球生物科技有限公司研發(fā)部提供, 由綠豆、銀花、茯苓、甘草.等組成[2].
1.3動(dòng)物, 小白鼠40只,昆明種(SPF級(jí)),健康,雌雄各半,鼠齡40天平均體重30克。購自湖南省長沙市天勤生物技術(shù)有限公司, 物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(湘)209-0014. 質(zhì)量檢測單位, 湖南省動(dòng)檢二站,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)單位:右江民族醫(yī)學(xué)院,使用許可證號(hào):SYXK桂2011-0010。).放空氣凈化鼠架裝置內(nèi),分籠喂養(yǎng),每籠6只,雌雄分開,由學(xué)院動(dòng)物室提供用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),自由飲用自來水。
1.4實(shí)驗(yàn)方法:
用健康小白鼠40只,分成4組,(1)、(2)、(3)為造模組,另設(shè)(4)為正常對(duì)照組.每組10只.用100mg/dl濃度HgCl2水溶液給小鼠腹腔注射染毒[3],每日一次,染毒 10 天后, (1綠豆組)、(2清千組)組開始分別用中藥綠豆提取液和海爾福清千口服液(綠豆、銀花、茯苓、甘草復(fù)方液)作灌胃干預(yù),以成人量折算, 劑量為0.1mL/只,每日一次,(3模型組)、(4正常對(duì)照組)組用等體積的蒸餾水灌胃,連續(xù)實(shí)驗(yàn)30日結(jié)束.測定染毒前, 染毒后,中藥灌胃干預(yù)后血紅蛋白(Hb). 結(jié)束從眼球后取血, ,分離血清, 測定生化指標(biāo):血清甘油三酯、總膽固醇、尿素氮、總蛋白參照文獻(xiàn)說明書測定;處死小鼠,取出大腦,稱重,在冷凍下研磨, 用生理鹽水制備10%腦組織勻漿,離心3000rpm,10min,后取上清液,放冰箱備用。
1.5測定方法
血紅蛋白(Hb)測定采用氰化高鐵血紅蛋白(HiCN)法,參照文獻(xiàn)[3]。測定腦勻漿乙酰膽堿酯酶(AchE)、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(chAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX),活力。Tc用COD-CE-PAP測定;TG用GPO-OAO法測定;尿素氮用脲酶波氏法測定;AchE根據(jù)乙酰膽堿在AchE催化下產(chǎn)生乙酸和膽堿,膽堿再與巰基顯色劑作用產(chǎn)生黃色化合物TNB(對(duì)稱三硝基苯),比色測定;具體操作按試劑盒說明書;清除率測定利用比色法[6],其原理: 由A液中三羥甲基氨基甲烷(Tris)、四甲基乙二胺(TEMED)與B液中過硫酸銨混合后,產(chǎn)生氧自由基(),經(jīng)鹽酸羥胺、對(duì)氨基苯磺酸、1-奈胺等連續(xù)反應(yīng), 產(chǎn)生一種黃色產(chǎn)物, 可以比色測定。具體操作參考文獻(xiàn)[4]。乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(chAT)測定是以乙酰輔酶A和膽堿為底物,在chAT催化下,反應(yīng)的生成物與顯色劑結(jié)合,在324nm處有吸收峰,以此測定并計(jì)算chAT活力. 具體操作按試劑盒說明書。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS軟件(13.0版)統(tǒng)計(jì),多組均數(shù)比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD法,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為a=0.05。結(jié)果用()表示。
2.結(jié)果
2.1一般情況.共用小鼠40只, 雌性 20 只,雄20只,4組每組10只. 綠豆組死亡2只, 模型組死亡2只, 清千組和正常對(duì)照組無死亡。
2.2染毒前, 染毒后,中藥灌胃干預(yù)后小鼠血紅蛋白(Hb)含量測定結(jié)果。 結(jié)果顯示,組間比較, 染毒前,小鼠血紅蛋白(Hb) 各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。染毒后,正常組明顯高于其他各組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中藥干預(yù)后, 正常組明顯高于其他各組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。
方差分析:組間比較;血紅蛋白Hb, 染毒前:各組間比較, F=1.605, p=0.203, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義。染毒后: 各組間比較, F=6.369, p=0.001,與正常組比較, ▲P<0.05, ▲▲P<0.01; 與綠豆組比較, ★P<0.05, ★★P<0.01差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義。中藥干預(yù)后: 各組間比較, F=16.635, p=0.0010,與正常組比較, ▲P<0.05, ▲▲P<0.01; 與綠豆組比較, ★P<0.05, ★★P<0.01; 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義。
組內(nèi)染毒前 、染毒后、中藥干預(yù)后(前中后)比較;綠豆組(前中后)比較,F(xiàn)=32.267, p=0.000,與中藥干預(yù)后比較,a P<0.01; 與染毒后比較,b P<0.01; 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義。清千組(前中后)比較,F(xiàn)=26.473, p=0.000,與中藥干預(yù)后比較,a P<0.01; 與染毒后比較,b P<0.01; 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義。模型組(前中后)比較,F(xiàn)=6.208, p=0.006,與染毒前比較,c P<0.05; b P<0.01; 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義。正常組(前中后)比較,F(xiàn)=2.155, p=0.135,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義。
2.3腦乙酰膽堿酯酶(AchE),乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(chAT), 腦谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力測定結(jié)果. 結(jié)果顯示, 腦乙酰膽堿酯酶(AchE), 組間比較: 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(chAT), 組間比較: 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 腦(GSH-PX)活力, 組間比較: 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 見表2。
方差分析:組間比較: 腦乙酰膽堿酯酶(AchE)活力:F=0.269,P=0.847, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義。; 腦(chAT)活力, :F=8.853,P=0.001, 與正常組比較, ★P<0.05, ★★P<0.01; 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 與綠豆組比較, ▲P<0.05, ▲▲P<0.01, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 腦(GSH-PX)活力,與正常組比較, ▲P<0.05, ▲▲P<0.01; 與模型組比較, ★★P<0.01; 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義;
2.4腦超氧陰離子自由基()清除率%、血清超氧陰離子自由基()清除率%,血清總蛋白測定結(jié)果. 結(jié)果顯示, 腦超氧陰離子自由基()清除率%、組間比較: 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 血清超氧陰離子自由基()清除率%, 組間比較: 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義;,血清總蛋白, 組間比較:,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義.見表3.
方差分析:組間比較: 腦自由基()(清除率% ):F=42.14,P=0.000, 與正常組比較,▲▲P<0.01, 與清千組比較, ★★P<0.01, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 血清自由基()(清除率% ), 組間比較: F=2.883,P=0.061差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 血清總蛋白, F=10.585,P=0.000, 與正常組比較, ★★P<0.01, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義;
2.5小鼠血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、尿素氮含量測定結(jié)果. 結(jié)果顯示,組間比較, 血清甘油三酯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 總膽固醇(TC), 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 尿素氮,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5 。
方差分析:方差分析:TG, 各組間比較,F(xiàn)=9.474,p=0.000, 與正常組比較,▲▲P<0.01, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 總膽固醇(TC), 各組間比較,F(xiàn)=0.449,p=0.685, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 尿素氮, 各組間比較,F(xiàn)=2.742,p=0.056,與清千組比較,★P<0.05, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
2.2染毒前、染毒后、中藥干預(yù)后小鼠體重測定結(jié)果. 結(jié)果顯示, 造模前、治療前,各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 治療后,各組間比較, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義;
方差分析:小鼠體重, 組間比較, 染毒前:各組間比較, F=0.119, p=0.948, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義。染毒后, F=6.040,p=0.002, 與組間比較, 與正常組比較,▲▲P<0.01, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 中藥干預(yù)后:各組間比較, F=2.350, p=0.089, 與正常組比較, ▲P<0.05, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義;
組內(nèi)前中后比較, 綠豆組,染毒前, 染毒后, 中藥干預(yù)后(前中后)比較, F=3.677, p=0.035,與染毒后比較, aP<0.05, 中藥干預(yù)后明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 清千組(前中后)比較, F=9.757, p=0.001, 與染毒后比較, b P<0.01, 染毒后明顯下降,中藥干預(yù)后明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 模型組(前中后)比較, F=0.428 p=0.656,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義; 正常組(前中后)比較, F=0.700 p=0.505,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意意義;
3討論
3.1本次實(shí)驗(yàn)染毒 10 天,綠豆組死亡2只, 模型組死亡2只, 清千組和正常對(duì)照組無死亡。
3.2造模后血紅蛋白下降,說明造血系統(tǒng)受到損害。汞對(duì)造血系統(tǒng)的抑制作用,主要對(duì)血紅素合成過程中關(guān)鍵酶的抑制,造成血紅素減少引起貧血[6]。
3.3腦乙酰膽堿酯酶(AchE),乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(chAT),是大腦中與記憶有關(guān)的關(guān)鍵酶,為科學(xué)界普遍公認(rèn),它們存在于大腦神經(jīng)細(xì)胞中,主要分布在海馬部位和皮層,乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶催化合成神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿,而乙酰膽堿酯酶則催化乙酰膽堿分解,它們的活性維持著乙酰膽堿合成與分解的平衡,從而維持著神經(jīng)傳導(dǎo)正常進(jìn)行和記憶。本實(shí)驗(yàn)表明,染毒小鼠乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性明顯下降,催化乙酰膽堿合成減少,而乙酰膽堿酯酶活性沒有降低,催化乙酰膽堿分解沒有降低,勢必造成神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿減少而影響記憶功能[7]。
3.4其他,腦(GSH-PX)活力和腦超氧陰離子自由基()清除率%、。(GSH-PX)活力是機(jī)體清除超氧陰離子自由基()重要的酶[4],汞中毒小鼠模型組(GSH-PX)活力明顯降低,低于正常組,表明清除超氧陰離子自由基()能力下降,而另一實(shí)驗(yàn)指標(biāo),超氧陰離子自由基()清除率%汞中毒組降低則證明了這點(diǎn)。而中藥干預(yù)組在模型組與正常組之間,表明清除超氧陰離子自由基()能力已明顯提升,綠豆組己接近正常組正常組。
3.5其他,從血清尿素氮含量表明,模型組最高,其次是綠豆組,最低是清千組,說明模型組腎臟排泄功能受到一定損害,而清千組保護(hù)腎臟排泄功能最好,血清尿素氮含量還低于正常組。體重變化表明,染毒三個(gè)組染毒后有降低,正常組沒有變化,中藥干預(yù)后有回升,由于后階段己停止染毒,所以模型組體重也緩慢升高,但較慢。正常組體重一直在升高,但由于時(shí)間僅30天,沒有太大變化。血清總膽固醇(TC)各組間差異無顯著性,而甘油三酯(TG)正常組明顯高于染毒三個(gè)組,血清蛋白染毒組還高正常組,表明汞染毒損害了肝臟對(duì)甘油三酯代謝,而對(duì)肝臟膽固醇代謝、蛋白代謝尚未損害到,一般認(rèn)為,肝臟代償能力較大,損害較嚴(yán)重時(shí)才引起蛋白異常。有關(guān)這方面的解釋,還需進(jìn)一步探討。
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第一作者:黃精貴,女,出生年月:1998年02月。右江民族醫(yī)學(xué)院2017級(jí)藥學(xué)本科班學(xué)生。通訊作者:李文仕,副主任藥師,E-mail: sqzhang224@163.com