康俊杰 王雪松 董李學 崔亞楠 周鑫 鄭百芹 劉洋 項愛麗

摘要 [目的]利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜技術建立蝦中38種農(nóng)藥殘留的快速篩查方法。[方法]采用50%乙腈水溶液作溶劑、QuEChERS提取鹽包和Oasis PRiME HLB固相萃取載體作吸附劑，實現(xiàn)了蝦肉樣品中38種目標物的同時提取和有效凈化。目標藥物經(jīng)ACQUITY UPLC HSS T3（1.8 μm，21 mm×50 mm）色譜柱分離，以10? mmol/L乙酸銨-甲醇和0.1%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，使用電噴霧離子源，在正離子模式下進行全掃描，可在10? min內(nèi)實現(xiàn)38種農(nóng)藥的良好分離。[結果]蝦中38種農(nóng)藥的定量限（LOQ）為0.5～1.5 μg/kg;3個加標水平的平均回收率為71.4%～97.9%，相對標準偏差（RSD）為4.1%～7.6%。[結論]該方法簡便快速、靈敏度較高，可用于蝦中38種農(nóng)藥的快速篩查。

關鍵詞 超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜;農(nóng)藥殘留;蝦;快速篩查

中圖分類號 TS 254.7? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）16-0193-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.052?? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Rapid Screening of 38 Pesticide Residues in Shrimp by Ultra Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry

KANG Jun-jie1，2，WANG Xue-song1，2，DONG Li-xue1，2 et al （1.Tangshan City Food and Drug Comprehensive Inspection and Testing Center，Tangshan，Hebei 063000;2.Hebei Agricultural Product Quality and Safety Testing Technology Innovation Center， Tangshan，Hebei 063000）

Abstract [Objective] An analytical method was established for the simultaneous determination of 38 pesticide residues in shrimp by ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry.[Method] Using 50% acetonitrile aqueous solution as the solvent， QuEChERS extraction salt packet and Oasis PRiME HLB solid-phase extraction carrier as the adsorbent， the simultaneous extraction and effective purification of 38 target substances in shrimp samples were achieved.The target drug was separated by ACQUITY UPLC HSS T3 （1.8 μm， 21 mm×50 mm） chromatographic column， and 10? mmol/L ammonium acetate-methanol and 0.1% formic acid aqueous solution were used as mobile phases for gradient elution.The electrospray ion source was used for a full scan in positive ion mode could achieve good separation of 38 pesticides within 10? minutes.[Result] The limit of quantification （LOQ） of 38 pesticides in shrimp was 0.5-1.5 μg/kg; the average recovery of the three spiked levels was 71.4%-97.9%， and the relative standard deviation （RSD） was 4.1%-7.6%.[Conclusion] The method is simple， rapid and highly sensitive， and can be used for rapid screening of 38 pesticides in shrimp.

Key words Ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry;Pesticides residues;Shrimp;Rapid screening

隨著人們生活水平的提高，蝦已經(jīng)成為日常生活的營養(yǎng)品之一，其安全性問題受到越來越多的關注。蝦的安全問題的主要表現(xiàn)是水體環(huán)境的污染，有機磷類農(nóng)藥由于殺蟲效果好、價格低、范圍廣等特點，使其成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要的農(nóng)藥品種。農(nóng)藥在水生生物體中富集，對人類的健康造成很大的隱患，亟需對其進行監(jiān)控[1-3]。人類長期進食含農(nóng)藥殘留的蝦肉，會對身體造成不良影響，如急性中毒、慢性中毒、干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)、毒害全身多臟器等危害，對身體健康的危害不容忽視[4-6]。農(nóng)藥一直以來是蔬菜水果中檢測的重點參數(shù)，但近幾年根據(jù)報道蝦肉中農(nóng)藥有檢出的現(xiàn)象。考慮到養(yǎng)殖者用藥的不確定性和復雜性，建立一種同時快速測定多種農(nóng)藥殘留的檢測方法刻不容緩。

目前，水產(chǎn)品中農(nóng)藥的快速檢測方法大都采用氣相質譜法和氣相色譜-質譜法[7-10]，而蝦中農(nóng)藥殘留的檢測報道較少[11-12]。為了提高大批量樣品的檢測效率，該研究采用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜法（UPLC-Q-TOF-MS法）快速篩查蝦中38種農(nóng)藥殘留，樣品經(jīng)過簡單的QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）前處理后，直接過Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化，以期為蝦的快速篩查提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 X500R超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（美國 SCIEX 公司）;高速冷凍離心機（湖南 cence湘儀產(chǎn)品）。

1.2 試材 乙腈、甲酸、甲醇均為色譜純（ 美國 Merck 公司）;乙酸銨（色譜純，美國Sigma公司）;Oasis HLB、Oasis PRIME HLB固相萃取柱、QuEChERS提取鹽包（美國 Waters公司）;十八烷基硅烷（ODS C 18，美國 Agilent 公司）;試驗用水為超純水（Millipore公司）。

標準品： 甲胺磷、甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜、氧樂果、毒死蜱、敵敵畏、敵百蟲、三唑磷、殺螟硫磷、馬拉硫磷、伏殺硫磷、亞胺硫磷、特丁硫磷砜、倍硫磷、辛硫磷、丙溴磷、治螟磷、蠅毒磷、滅線磷、殺撲磷、樂果、甲基異柳磷、二嗪磷、甲氰菊酯、三唑酮、異菌脲、異丙甲草胺、秀滅凈、氯苯嘧啶醇、涕滅威、涕滅威砜、克百威、3-羥基克百威、甲萘威、異丙威、多菌靈、吡蟲啉，純度均≥98%，天津阿爾塔科技有限公司。

1.3 標準溶液配制

分別吸取1 mL上述標準品，置于10 mL棕色容量瓶中，用丙酮定容至刻度，制成10 μg/mL的標準儲備液，-20 ℃保存。試驗用丙酮稀釋上述標準儲備液，配制成不同濃度的混合標準使用液，于4 ℃保存。

1.4 樣品預處理

取2.00 g均質的蝦肉樣品至50 mL離心管中，加入50%乙腈水20 mL混勻，用手振搖樣品1 min。然后加入QuEChERS提取包，并大力振搖離心管1 min。在3 500 r/min高速離心5 min，取5 mL上清液直接過Oasis PRIME HLB固相萃取柱，收集流出液。在40 ℃下氮吹近干，用1 mL流動相復溶，過0.22 μm濾膜，上機待測定。

取2.00 g蝦肉空白樣品，每份樣品按上述過程進行處理，得到的基質提取液用來稀釋標準儲備液。

1.5 色譜-質譜條件

1.5.1 液相色譜條件。色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3 （1.8 μm，21 mm×50 mm）;柱溫45 ℃;進樣體積10 μL;流速0.300 mL/min;流動相A為水相體積分數(shù)0.1%甲酸水，B為有機相10 mmol/L乙酸銨-甲醇。梯度洗脫程序為0～0.5 min，A為95%，0.5～2.0 min，A由95%線性降至70%，2.0～8.0 min，A由70%線性降至5%，再回到初始狀態(tài)保持2 min。

1.5.2 質譜條件。采用電噴霧離子源（ESI），掃描方式為正離子模式（ESI+），掃描范圍為 m/z ?80～1 000，毛細管電壓 5.5 kV;鞘氣壓力344.7 kPa，氣簾氣壓力241.3 kPa，溫度500 ℃，輔助氣壓力344.7 kPa，碰撞反應氣壓力48.3 kPa;去簇電壓80 V，碰撞能量10 V;為了保障質量數(shù)精度，用SEIEX公司提供的ESI+溶液，對儀器質量軸進行質量校正，參比離子為 ?m/z 132.904 88、m/z 266.159 81、m/z 354.212 24、m/z 442.264 67、m/z 609.280 66、m/z 829.539 33、m/z 961.436 94、m/z 146.732 24、m/z 1 561.603 30、m/z 2 034.625 45和 m/z 2 149.496 51。

2 結果與分析

2.1 液相色譜條件優(yōu)化 該試驗選用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱進行分析，考察了0.1%甲酸水、1%甲酸水、10 mmol/L 乙酸銨-甲醇、10 mmol/L 乙酸銨-乙腈、乙腈和甲醇6種流動相對38種農(nóng)藥的分離、離子化效率和峰型的影響。結果表明，當流動相不加酸或酸度較高時，38種目標化合物的響應值都偏小，提取的效率低。當選用0.1%甲酸水時，目標化合物的峰分離較好，響應值增大，峰形好。而不加10 mmol/L乙酸銨的甲醇或乙腈的色譜峰明顯提前，分離效果較差，部分化合物的提取效率低。與乙腈相比，甲醇作為流動相可以獲得更好的分離度，所以試驗水相采用0.1%甲酸水，有機相采用10 mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動相進行梯度洗脫，實現(xiàn)目標化合物的有效分離。

2.2 質譜條件優(yōu)化

根據(jù)國內(nèi)近幾年在蝦、蟹等水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢出情況，最終確定了38種常用農(nóng)藥。將這38種目標化合物配制成質量濃度為100 ng/mL的混合標準溶液。應用超高效液相色譜儀進行色譜分離，Q-TOF進行質譜信息采集，在ESI正離子模式下，在 m/z ?80～1 000范圍內(nèi)進行一級質譜全掃描分析，在不同的碰撞電壓下進行二級質譜掃描分析，收集化合物的保留時間、母離子精確分子質量、質量誤差、二級全掃描圖及質譜碎片數(shù)據(jù)等信息，以此建立完整的38種農(nóng)藥的質譜篩查譜庫。譜庫中應包含38種目標化合物的名稱、保留時間等信息，具體分析參數(shù)見表1。通過比較各目標化合物的離子色譜峰的響應值和分離度，分別優(yōu)化毛細管電壓、鞘氣壓力、輔助氣壓力、去簇電壓、碰撞能量等質譜參數(shù)，38種農(nóng)藥的提取離子色譜圖見圖1，以毒死蜱為例，其一級質譜圖和二級質譜圖見圖2。

2.3 樣品前處理方法的選擇 該試驗比較不同提取溶劑，提取目標化合物，同時沉淀蛋白。選擇體積分數(shù)10%乙腈水、50%乙腈水、80%乙腈水作為3種提取液，進行加標水平為50 μg/kg 的回收率試驗，平行測定3次。結果顯示，不同提取溶劑對 38種農(nóng)藥殘留的提取效果相差不多。50%乙腈水的提取回收率為78.2%～92.4%，相對標準偏差（RSD）為3.5%～5.3%，優(yōu)于10%乙腈水（回收率為 53.8%～82.1%，RSD為4.2%～7.1%）和80%乙腈水（回收率為67.0%～83.2%，RSD為4.1%～8.2%）。因此該試驗最終選擇50%乙腈水作為提取溶劑。

蝦肉樣品中含有豐富的蛋白和脂肪等干擾物會造成試驗過程基質干擾，因此對蝦樣品進行凈化處理是必要的。該試驗選取了Oasis PRIME HLB、Oasis HLB、C 18這3種固相萃取柱進行比較試驗，結果表明，與Oasis HLB和C 18相比，Oasis PRIME HLB固相萃取柱能有效去除基質干擾，基質抑制改善明顯，目標化合物均有較高的回收率。同時比較了Oasis PRIME HLB柱無活化和平衡過程，采用直接上樣品凈化方式，對38種農(nóng)藥目標化合物進行處理，結果表明，此固相萃取柱活化平衡步驟對此次試驗的38種目標化合物回收率影響不大，故選用Oasis PRIME HLB小柱進行凈化，達到樣品中目標化合物快速篩查的目的。

2.4 方法學驗證

2.4.1 標準曲線和定量限。

用空白的蝦肉樣品基質，配制標準溶液。以化合物的離子峰面積 Y 為縱坐標、相應質量濃度 X （μg/kg）為橫坐標繪制標準曲線，38種農(nóng)藥的相關系數(shù)、線性范圍和定量限見表2。取空白蝦肉樣品，按該試驗方法進行樣品的預處理，得到各目標化合物的信噪比為10 （S/N =10）的濃度，確定各目標化合物的定量限（LOQ）。從表2可看出，在 0.5～50.0 μg/kg 38種目標化合物的線性關系良好（ R2 >0.99），且其定量限為0.5～1.5 μg/kg。

2.4.2 回收率和精密度。

在空白蝦肉樣品中添加3個不同濃度（5、10、20 μg/kg）的38種混合標準溶液，按“1.4”方法進行提取，用UPLC-Q-TOF進行測定目標化合物。每一個添加濃度重復測定6次進行試驗，計算平均回收率和RSD。結

果發(fā)現(xiàn)，蝦肉中38種農(nóng)藥的加標回收率為71.4%～ 97.9%，

RSD為4.1%～7.6%。

2.5 樣品分析 按該試驗方法對唐山地區(qū)超市、農(nóng)貿(mào)市場采集到的30批蝦樣品進行篩查檢測分析，結果發(fā)現(xiàn)均未檢出該研究的38種農(nóng)藥。

3 小結

該研究建立了超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF）測定蝦肉樣品中38種農(nóng)藥殘留的快速篩查方法，其前處理過程簡單、快速、通量大、準確性高。UPLC-Q-TOF法在蝦肉樣品中農(nóng)藥殘留快速篩查檢測方面有明顯優(yōu)勢，可一次分析出數(shù)百種不同目標化合物，在農(nóng)藥殘留篩查領域值得深入研究。

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