馬傳貴 張志秀 李紅芳

【摘要】目的：以姬松茸-灰樹花-蛹蟲草制成的復合多糖，以免疫抑制小鼠細胞免疫功能為主要指標，探究比較復合多糖與各單一多糖對免疫低下小鼠免疫調節(jié)功能影響的差別。方法：通過檢測小鼠細胞免疫功能和體液免疫功能，并對相關指標進行檢驗。結果：復合多糖組小鼠的體質量高于同性別的其他單一多糖組；各多糖組小鼠胸腺系數(shù)均有不同程度的升高，其中復方多糖組效果最好；復合多糖組IgG、IgA、IgM、sIgA水平升高效果，較單一多糖組血清好；在血液、脾臟T細胞各亞群及比值方面，復合多糖升高較好，血液CD4-CD8+降低效果亦優(yōu)于單一多糖組；復合多糖組T淋巴細胞增殖率高于單一多糖組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：復合多糖對小鼠細胞免疫、體液免疫和T淋巴細胞功能有較好的改善作用，能顯著改善免疫抑制小鼠的免疫功能。

【關鍵詞】姬松茸；灰樹花；蛹蟲草；復合多糖；小鼠；免疫功能

[中圖分類號]R285.5 [文獻標識碼]A [文章編號]2096-5249（2021）03-0005-04

Effects of compound polysaccharides from Agaricus blazei murrill- Griflola frondosa-Cordyceps militaris on the immunological function in immunosuppressive mice

MA Chuan-gui1， ZHANG Zhi-xiu1， LI Hong-fang2* （1. Beijing Jingcheng Biotechnology Company Limited， Beijing 102600， Chnia； 2. Yunnan University of Chinese Medicine，Kunming Yunnan 650500， Chnia）

[Abstract] Objective： To compare the effect of compound polysaccharide and single polysaccharide on the immunoregulation of immunocompromised mice. Methods： the cellular immune function and humoral immune function of mice were tested. Results： the body weight of mice in compound polysaccharide group was higher than that of other single polysaccharide groups of the same sex； the thymus coefficient of mice in each polysaccharide group increased to different degrees， and the effect of compound polysaccharide group was the best； the effect of compound polysaccharide group was better than that of single polysaccharide group in serum IgG， IgA， IgM， SIgA； the effect of compound polysaccharide was better than that of single polysaccharide in blood CD4 / CD8， spleen CD4 / CD8， and blood CD4-CD8 +The results showed that the effect of decreasing was good， the effect of increasing T-lymphocyte proliferation rate of compound polysaccharide group was better than that of single polysaccharide group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： the compound polysaccharide has a better effect on improving the cellular immunity， humoral immunity and T lymphocyte function of mice， and can significantly improve the immune function of immunosuppressed mice.

[Key words] Agaricus blazei murrill； Griflola frondosa； Cordyceps militaris； Compound polysaccharides； mice； immunological function

多糖廣泛存在于動植物以及真菌體內，組成和結構上的差異亦使其生物學活性復雜多樣，植物多糖分子存在2-10個單糖聚合而成的寡糖片段，通過與蛋白受體結合，激活巨噬細胞、自然殺傷細胞和樹突狀細胞（dendritic cell，DC）等免疫細胞表面存在的多糖受體，產(chǎn)生類似酶作用過程的效果，進而影響淋巴細胞基因表達，促使T、B淋巴細胞的增殖，調節(jié)細胞因子分泌、活化補體，促進抗體產(chǎn)生等[1][2][3]。姬松茸多糖有廣泛的藥理活性，在抗腫瘤、增強免疫力、抗皰疹病毒、影響造血功能等方面優(yōu)勢突出[4]；灰樹花多糖具有腫瘤增殖抑制、免疫調節(jié)作用，較好的降糖和抑菌、抗病毒作用[5]；蛹蟲草多糖具有保肝抗肝炎、抗氧化、抗癌等生物活性，是一種非特異性免疫增強劑[6]。研究表明，單一活性多糖按優(yōu)化的組合比例組合，其生物活性更強。本研究的復合多糖由姬松茸多糖、灰樹花多糖、蛹蟲草多糖根據(jù)多糖含量按1：1：1比例組成，以免疫抑制小鼠細胞免疫功能為主要指標探究比較姬松茸-灰樹花-蛹蟲草的復合多糖與各單一多糖對免疫低下小鼠免疫調節(jié)功能影響的差別，從而為復合多糖在增強免疫功能方面是否有相互協(xié)同作用提供思路。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 食用菌復合多糖（姬松茸-灰樹花-蛹蟲草）、姬松茸多糖、灰樹花多糖、蛹蟲草多糖均由我機構提供；4通道AccuriC6流式細胞儀、流式抗體CD4-FITC、CD8-PE、CD3-PerCP熒光抗體及同型對照抗體、校準微球、紅細胞裂解液均購于美國BD公司；小鼠免疫球蛋白檢測IgG、IgA、IgM試劑盒購于美國ICLLAB公司；刀豆蛋白（ConA）購自美國Sigma公司；CCK8由我機構提供，環(huán)磷酰胺標準品（批號：C3250000），為山西普德藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；Sysmex XT-2000iv血液分析儀專用試劑購自日本Sysmex公司。

1.2供試動物 健康雌雄小鼠120只，8～10周齡，雌雄各半，體重為（20±2）g，由我機構實驗動物中心提供。動物合格證號為：SCXK（京）2018-0010。晝夜交替飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20℃～22℃。

1.3試驗方法 ①動物分組及處理[7]：將實驗小鼠隨機正常對照組、模型對照組、復合多糖組及姬松茸多糖、灰樹花多糖、蛹蟲草多糖3個單一多糖組，每組20只小鼠，雌雄各10只。正常對照組和模型對照組，灌胃蒸餾水，體積為10mL/kg；各多糖組分別相應等體積多糖成品灌胃，連續(xù)31d；除正常對照組外，其他各組在灌胃后第24d開始注射環(huán)磷酰胺（CTX）（40mg/kg/d，ip），連續(xù)3d。次注射后第5d，脫頸椎處死，取胸腺和脾臟精密稱取。②血液學檢測：給藥第31d解剖小鼠，摘眼球采血，用XT-2000iv血液分析儀測定血RT、WBC總數(shù)及分類計數(shù)、Rtc比例等。③脾細胞制備：無菌取出脾臟，剪碎，過篩，輕輕吹開脾臟細胞，在4℃下1100r/min離心10min，棄上清液，再懸浮細胞，加入紅細胞裂解液，攪拌均勻，裂解約5min，加入5mL PBS，終止裂解，在轉速1100r/min，4℃環(huán)境下，離心10min，棄上清液，清洗，在RPMI-1640中培養(yǎng)，重懸浮細胞，稀釋，計數(shù)脾細胞。④血液淋巴細胞CD3/CD4/CD8、脾淋巴細胞分群：在50μL小鼠靜脈全血中，加入按比例CD3/CD4/CD8混合抗體8μL；同樣體積加入制備好的脾細胞（5×106/mL）50μL，以及CD3/ CD4/CD8/CD69按比例混合抗體13μL。上述兩組管內環(huán)境均室溫下避光，孵育30min；裂解紅細胞，清洗2次；加細胞固定液100μL/管進行流式分析。⑤血清IgA、IgG、IgM含量測定，按試劑盒要求用夾心ELISA法檢測。⑥腸黏液采集與處理檢測sIgA：取回盲部小腸，縱切，輕輕刮腸腔，除去糞便，載玻片輕刮去腸黏膜表面黏液，放入埃彭多夫微量離心管中，用0.9%氯化鈉注射液3mL反復沖洗整個小腸腔，用5mL無菌離心管收集沖洗液，充分震蕩混勻，在4℃、1500r/min環(huán)境下，離心5min，收集上清液，測定sIgA。⑦脾淋巴細胞增殖檢測：使用96型號板孔，并設3個復孔，加入90μL脾細胞（5×106/mL）和10μL刀豆蛋白ConA（50μg/mL）孵育40h，分別加入CCK8試劑，采用450納米波長檢測，計算增殖率。

1.4實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料描述以均數(shù)±標準差表示，多個樣本均數(shù)比較，經(jīng)方差齊性和正態(tài)分布檢驗后采用單因素方差分析，采用t檢驗進行組間比較；計數(shù)資料描述以率、百分比等一般性描述，采用卡方檢驗或Fisher精確概率法進行比較，以P<0.05或P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1復合多糖對CTX致免疫低下小鼠體質量的影響實驗數(shù)據(jù)顯示，給藥第31d，對照組及各多糖組同性別小鼠，各組組間小鼠體質量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但同性別比較，姬松茸-灰樹花-蛹蟲草的復合多糖組小鼠的體質量明顯高于高于其他單一多糖組（姬松茸多糖組、灰樹花多糖組、蛹蟲草多糖組）（P<0.05），詳見表1。

2.2復合多糖對CTX致免疫低下小鼠胸腺系數(shù)的影響

結果如圖1所示，與正常對照組比較，模型對照組小鼠胸腺系數(shù)顯著降低（P<0.05或P<0.01）。其他多糖組別小鼠胸腺系數(shù)較免疫低下小鼠的模型對照組均有一定程度的升高，升高幅度以復合多糖組最高（P<0.05）。

2.3復合多糖對CTX致免疫低下小鼠體液免疫的影響結果 如表2所示，與正常對照組比較，模型對照組小鼠血清IgG、IgA、IgM、sIgA水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與免疫低下小鼠的模型對照組比較，其他多糖組別小鼠血清IgG、IgA、IgM、sIgA水平都呈現(xiàn)出不同程度的增加，增加幅度以復合多糖組最高（P<0.05）。

2.4復合多糖對CTX致免疫低下小鼠T淋巴細胞分化成熟的影響結果 如圖2～圖4所示，與正常對照組比較，模型對照組在血液CD4/CD8、脾臟CD4/CD8均顯著升高，血液CD4-CD8+均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。其他多糖組小鼠較單純免疫低下小鼠的模型對照組，其血液CD4-CD8+均呈現(xiàn)一定程度的升高，血液及脾臟CD4/CD8均出現(xiàn)不同程度降低，效果以復合多糖組最優(yōu)（P<0.05）。

2.5復合多糖對CTX致免疫低下小鼠T淋巴細胞增殖能力的影響結果 如圖5所示，與正常對照組比較，模型對照組小鼠T淋巴細胞增殖率顯著降低（P<0.05）。其他多糖組與模型對照組比較，復合多糖組的T淋巴細胞增殖率升高效果高于單一多糖組。

3 討論

現(xiàn)代社會生活節(jié)奏快，工作壓力大，人體免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病率隨之上升，目前調節(jié)機體免疫力藥物主要以化學合成藥物為主，但其副作用明顯，療效持續(xù)較短、藥物殘留體內、用藥時間成本過長等。而中草藥成為近年研究熱點，因其具有藥效持續(xù)時間長、無機體藥物殘留、對機體影響小等優(yōu)點。目前已開發(fā)有一百種以上的中藥多糖類化合物均發(fā)現(xiàn)具有免疫促進作用。姬松茸多糖、灰樹花多糖、蛹蟲草多糖等真菌類多糖大多具有抗氧化、抗癌、增強機體免疫功能等生物活性，是一種非特異性免疫增強劑。本研究通過CTX導致的免疫低下模型造模方法，使實驗小鼠體質量增長減緩，胸腺系數(shù)降低，血清免疫球蛋白水平降低，探討給予小鼠以上按一定比例組成的復合多糖，是否對免疫低下小鼠的免疫力具有增強的作用。

免疫球蛋白分泌的量，反映了體液免疫的功能[8]。CD4和CD8是T淋巴細胞重要的表面抗原，輔助性T細胞（Th）屬于CD4+T細胞亞群，細胞毒性T細胞和抑制性T細胞（Ts）屬于CD8+T細胞。各亞群數(shù)量和功能產(chǎn)生異常時，細胞免疫應答及遲發(fā)型超敏反應、細胞毒作用均受到抑制，機體免疫系統(tǒng)紊亂并發(fā)生病理變化。ConA是促細胞有絲分裂素，可使大量T細胞克隆活化[9]，當T淋巴細胞功能增強時，ConA能激發(fā)其更快增殖，從而提高小鼠細胞免疫水平。

綜上所述，本研究等劑量姬松茸多糖-灰樹花多糖-蛹蟲草多糖的復合多糖，對于提高小鼠細胞免疫、體液免疫，以及增強T淋巴細胞功能均有更好的作用，可顯著改善免疫抑制小鼠免疫功能，說明這三種多糖的復合多糖在增強免疫功能方面有相互協(xié)同作用，值得臨床推廣，研究其更好地混合比例，以期取得更精確的增強免疫功能效果。

參考文獻

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作者簡介：馬傳貴（1985-），男，高級菌類園藝工，中藥師，主要從事食藥用菌的科學研究、開發(fā)應用和科普教育工作。E-mail：lingzhichina@126.com

*通信作者：李紅芳（1974-），女，講師，理學博士，主要從事天然藥物化學分析。E-mail：625584065@qq.cocm