邢亞東，羅凱文，馬康，李?yuàn)檴?/p>

1.蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233030；2.悅康藥業(yè)集團(tuán)安徽天然制藥有限公司，安徽 太和 236600

斑蝥酸鈉注射液收載于《化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品種名單》中［1］，屬于抗腫瘤藥，該藥可直接進(jìn)入肝癌細(xì)胞核及核仁內(nèi)，抑制癌細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA合成，影響癌細(xì)胞的核酸代謝，繼而使癌細(xì)胞形態(tài)和功能發(fā)生變化，殺死癌細(xì)胞，主要用于原發(fā)性肝癌、肺癌等癌癥的治療［2-4］。斑蝥酸鈉主要用于白細(xì)胞低下癥及肝炎、肝硬化、乙型肝炎［5-7］，臨床應(yīng)用較為廣泛。因斑蝥酸鈉注射液中斑蝥酸鈉的原標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法為氣相色譜法（gas chromatography，GC），具體過程為“以甲基硅膠（SE-30）為固定液，涂布濃度為10%；柱溫為180℃；氯仿溶解正十六烷，作為內(nèi)標(biāo)溶液。取斑蝥素對(duì)照品適量，精密稱定，加內(nèi)標(biāo)液適量，氯仿定容，作為對(duì)照品溶液。精密量取本品適量置錐形瓶中，加1 mol·L-1硫酸，氯仿萃取3次，每次10 min；萃取液合并，70℃水浴揮去氯仿至約5 mL，精密加內(nèi)標(biāo)液1 mL。混勻，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，用氯仿稀釋至刻度，搖勻，即為供試品溶液。測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算含量，再乘以1.316，即得?！保?］該過程使用的GC價(jià)格昂貴、操作較為繁瑣；樣品處理過程相對(duì)復(fù)雜、所用試劑毒性及危險(xiǎn)性較大，在萃取過程中目標(biāo)成分易損失，同時(shí)該檢測(cè)過程對(duì)檢測(cè)人員的整體素質(zhì)要求較高。關(guān)于使用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測(cè)斑蝥酸鈉注射液中斑蝥酸鈉的含量無相關(guān)的報(bào)道［8-10］。為確保藥品在臨床使用中劑量更加精確以及藥品在生產(chǎn)過程中盡量減少對(duì)環(huán)境的污染，需要建立穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法控制該藥品的質(zhì)量?，F(xiàn)采用HPLC法定量測(cè)定斑蝥酸鈉注射液中斑蝥酸鈉的含量，可為斑蝥酸鈉注射液的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1藥物與試劑斑蝥酸鈉對(duì)照品（純度：99.0%，上海景榮化學(xué)科技有限公司，批號(hào)：20190930）；斑蝥酸鈉維注射液（悅康藥業(yè)集團(tuán)安徽天然 制 藥 有 限 公 司，批 號(hào)：19051201、19051202、19051203、19072101、19072102、19072103、19090601、19090602、19090603、19121401、19121402、19121403，規(guī)格：每支10 mL，每支含斑蝥酸鈉0.5 mg）；甲醇、乙腈均為色譜純（TEDIA COMPANY，INC.），其余試劑均為分析純。

1.2儀器UltiMate3000型高效液相色譜儀（配置包括自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)賽默飛公司），GC2010plus氣相色譜儀（日本島津公司）；BT125D型十萬分之一電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；Esw Plus10型超純水機(jī)（上海茸研儀器有限公司）；IKA RV 10 digital V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKA Germany）；XZ133-SB-800D型高功率數(shù)控超聲波清洗器（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司）。

2 方法

2.1色譜條件采用Phenomenex C18色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm），流 動(dòng)相為 乙腈-0.02 moL·L-1磷酸二氫鉀，等度洗脫，流速1.0 mL·min-1，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。

2.2溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取斑蝥酸鈉對(duì)照品適量，加純水溶解并定容，制備成濃度為0.661 9 g·L-1的對(duì)照品溶液。

2.2.2 樣品溶液的制備 精密量取樣品溶液100 mL，60℃旋蒸濃縮至約5 mL，濃縮液轉(zhuǎn)移至10 mL棕色量瓶?jī)?nèi)并加水定容，即得。避光保存。

3 結(jié)果

3.1系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)在室溫條件下，分別取斑蝥酸鈉對(duì)照品、供試品溶液適量，按色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1。供試品和對(duì)照品溶液色譜圖相對(duì)應(yīng)的位置上有相同的吸收峰。理論板數(shù)按斑蝥酸鈉計(jì)均大于6 000，斑蝥酸鈉與其他相鄰峰之間的分離度滿足ChP相關(guān)要求。

圖1 斑蝥酸鈉注射液色譜圖

3.2線性關(guān)系的考察分別精密量取“2.2”項(xiàng)下斑蝥酸鈉對(duì)照品溶液2μL、4μL、6μL、8μL、10μL注入高效液相色譜儀，記錄斑蝥酸鈉峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得斑蝥酸鈉回歸方程分別為Y＝0.753 3X＋0.062 0（r＝0.999 8）。結(jié)果表明斑蝥酸鈉在1.323 8～6.619 0μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取濃度為0.661 9 g·L-1斑蝥酸鈉對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄斑蝥酸鈉峰面積，得出RSD值為0.64%，表明儀器精密度良好。

3.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一供試品溶液（批號(hào)：19051201）適量，按色譜條件分別在0 h、1 h、3 h、6 h、15 h、24 h重復(fù)進(jìn)樣一次，記錄斑蝥酸鈉峰面積，RSD值為1.17%。結(jié)果表明斑蝥酸鈉在該條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)（批號(hào)：19051201）供試品適量，按樣品制備方法平行制備供試品溶液6份。按色譜條件進(jìn)樣分析，記錄斑蝥酸鈉峰面積，RSD值為0.83%。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

3.6加樣回收率實(shí)驗(yàn)取已知含量的斑蝥酸鈉注射液（批號(hào)：19051201）樣品15份，分3組，每份約50 mL，精密量取，置于100 mL量瓶中，再分別精密加入一定量的斑蝥酸鈉對(duì)照溶液（分別相當(dāng)于含量的80%、100%、120%的量）并加水定容，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述測(cè)定含量的方法測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算得斑蝥酸鈉的平均回收率為98.51%，RSD為0.96%（n＝15）。結(jié)果表明該法加樣回收率良好。見表1。

表1 斑蝥酸鈉注射液中斑蝥酸鈉加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （n＝15）

3.7樣品含量測(cè)定取收集的12批斑蝥酸鈉注射液適量，精密量取適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按相應(yīng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并記錄斑蝥酸鈉峰面積，計(jì)算斑蝥酸鈉含量，同時(shí)按國(guó)家相應(yīng)的原標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法（GC法）對(duì)12批樣品中斑蝥酸鈉的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 含量測(cè)定結(jié)果 （n＝3）

4 討論

斑蝥酸鈉為斑蝥素的衍生物，與斑蝥素比較，其抗腫瘤療效確切，不良反應(yīng)較少［11-13］，可有效改善放、化療的不良反應(yīng)，提高腫瘤患者的免疫功能及生存質(zhì)量，為臨床常用藥［14-16］。但斑蝥酸鈉注射液收載的檢測(cè)方法為GC法，該法制備樣品較為復(fù)雜，目標(biāo)成分易損失，而其他的檢測(cè)方法報(bào)道較少。針對(duì)上述存在的問題，本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法測(cè)定斑蝥酸鈉注射液中斑蝥酸鈉的含量，并對(duì)所建立的相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行摸索與優(yōu)化，從而為其質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

對(duì)斑蝥酸鈉在紫外條件下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)其在193 nm和230 nm處有最大吸收，對(duì)樣品使用193 nm波長(zhǎng)進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，基線波動(dòng)不利于整個(gè)測(cè)定過程的順利進(jìn)行，而230 nm波長(zhǎng)時(shí)基線較穩(wěn)，更有利于檢測(cè)過程的進(jìn)行。因此，選擇230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

采用HPLC法測(cè)定斑蝥酸鈉的文獻(xiàn)較少，故本次實(shí)驗(yàn)分別摸索了甲醇、乙腈-水［17-20］；乙腈-0.02 moL·L-1磷 酸 二 氫 鉀 溶 液［21-24］；乙 腈-0.1%磷酸（三乙胺調(diào)pH為2.80）［25-28］；乙腈-0.1%磷酸水溶液［29-30］；乙腈-0.005 moL·L-1辛烷磺酸鈉溶液（用H3PO4調(diào)pH為2.50）等流動(dòng)相體系［31］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含甲醇的流動(dòng)相體系對(duì)實(shí)驗(yàn)有干擾，原因可能為甲醇存在末端吸收，斑蝥酸鈉在乙腈-0.1%磷酸（三乙胺調(diào)pH為2.80）；乙腈-0.1%磷酸水溶液；乙腈-0.005 moL·L-1辛烷磺酸鈉溶液體系中峰型的對(duì)稱度較差，拖尾嚴(yán)重；且辛烷磺酸鈉屬于大分子物質(zhì)，在流動(dòng)相的制備和使用過程中容易產(chǎn)生氣泡，不利于整個(gè)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行和儀器的保護(hù)，在乙腈-0.02 moL·L-1磷酸二氫鉀溶液體系中保留時(shí)間較為合適、峰型較好、柱效較高，有利于整個(gè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)樣品的實(shí)際情況建立的HPLC法測(cè)定斑蝥酸鈉注射液中斑蝥酸鈉含量只需對(duì)樣品溶液進(jìn)行簡(jiǎn)單的濃縮、定容，樣品處理過程簡(jiǎn)單、方便、易操作，儀器使用簡(jiǎn)便，且測(cè)定結(jié)果較為穩(wěn)定。所建立的方法與原標(biāo)準(zhǔn)中收載的方法相比存在一定的優(yōu)勢(shì)，該方法可用于對(duì)斑蝥酸鈉注射液質(zhì)量進(jìn)行控制，為進(jìn)一步改進(jìn)斑蝥酸鈉的檢測(cè)方法奠定了一定的基礎(chǔ)。