陳志健 繆祿聲 袁浩南 張旺發(fā) 孔連廣 魏宜勝

【關鍵詞】結直腸癌;增殖;遷移;長鏈非編碼RNA;癌基因SEI1;

結直腸癌是常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率、病死率高且逐年上升，預后較差[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移是結直腸癌患者死亡的主要原因，因而探究結直腸癌的發(fā)生發(fā)展機制，為結直腸癌靶向治療提供科學基礎，對于提高結直腸癌的治愈率至關重要。然而，目前仍未完全清楚結直腸癌腫瘤進展的具體機制。據(jù)相關研究，已知在這一過程中涉及到多基因的異常表達，如PIK3CA的基因突變、癌基因Ras的激活、抑癌基因p53的失活等，這些都是編碼蛋白的基因[2-4]。此外，尚有不編碼蛋白質(zhì)的RNA，稱為非編碼RNA（ncRNA），在結直腸癌進展過程中起重要的調(diào)控作用[2]。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類位于胞漿或細胞核部分、長度大于200個核苷酸的RNA，lncRNA基本不參與編碼蛋白，也屬于ncRNA，可通過參與遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多個層面調(diào)節(jié)疾病的發(fā)生、發(fā)展[5]。相關研究表明，lncRNA廣泛參與生理和病理各個過程，特別在癌癥中具有重要的調(diào)節(jié)作用[6]。癌基因SEI1（又名SERTAD1或TRIP-Br1）是一個位于19q13.1至19q13.2的細胞周期調(diào)控基因，在許多癌癥中該基因均有異常表達。SEI1基因產(chǎn)物p34SEI1是Sertad家族的一部分，它是一種周期蛋白依賴激酶4（CDK4）結合蛋白，通過促進CDK4–CCND復合物的締合和刺激CDK4的活性來對抗p16對細胞周期進程的抑制活性[7-8]。相關研究顯示SERTAD1的過表達與頭頸癌有關[9]。此外，SERTAD1差異表達還與多種癌癥類型相關，例如肺癌、乳腺癌、結腸癌、腎癌、白血病和淋巴瘤[10]。通過生物信息學分析序列對比，查找SERTAD1，發(fā)現(xiàn)該編碼基因附近存在lncRNA，即lnc-SERTAD1-1，其染色體位置非常靠近SERTAD1，作為上游因子的一個反式作用因子與順式作用元件結合，參與基因表達的調(diào)控。目前，關于lnc-SERTAD1-1在結直腸癌中的功能和作用機制報道較少。本研究組旨在分析lnc-SERTAD1-1在結直腸癌中的表達水平及對預后的影響，探究lnc-SERTAD1-1對結直腸癌增殖及轉(zhuǎn)移的影響，以期為結直腸癌治療提供新的靶標。

材料與方法

一、材料

1.標本

收集2009年3月至2012年2月廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院胃腸外科的125例結直腸癌患者的標本（手術切除），標本為配對的癌組織和癌旁正常組織（距癌組織≥5cm的邊緣）。本組結直腸癌患者的入選標準：①接受切除術且術后病理活組織檢查（活檢）明確診斷為結直腸癌;②術前均未進行放射治療、化學治療或其他抗癌治療;③術后隨訪結果完整，生存、復發(fā)和轉(zhuǎn)移等情況明確。排除標準：①非原發(fā)性結直腸癌者;②家族性息肉病惡變者。所有結直腸癌患者的腸癌及癌旁正常組織標本采集以RNA保護液處理并以液氮保存。術后隨訪以首次診斷之日為起點，總生存以術后死亡為隨訪終點。術后出現(xiàn)復發(fā)轉(zhuǎn)移作為無病生存的隨訪終點。術后第1年每3個月隨訪1次，之后每6個月門診隨訪1次。隨訪方式以電話、微信和門診復查相結合。隨訪截止時間為2018年2月，隨訪時間中位數(shù)為83個月，所有患者均簽署知情同意書，且本研究經(jīng)廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

2.細胞株

人結直腸癌細胞HCT15及人源胚胎細胞293T均由廣州醫(yī)科大學分子流行病學實驗室呂嘉春教授惠贈。正常人結腸組織細胞CCD-18Co購自杭州美森細胞生物有限公司。HCT15用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，CCD-18Co、293T用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，當細胞生長的融合度為70%～80%時，取生長狀態(tài)好的細胞用于實驗。

二、試劑與儀器

BiooPureTMRNAIsolationReagent購自BiooScientific，DEPC處理水購自北京萊索寶科技有限公司，PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser購自Takara，TE緩沖液購自北京萊索寶科技有限公司，SYBRGreen實時定量PCR試劑盒購自DBIBioscience;lnc-SERTAD1-1引物委托廣州復能基因有限公司合成，7900T熒光定量PCR儀購自cABI，-80℃超低溫冰箱購自ThermoScientific，ND-1000自動紫外分光光度計購自ThermoScientific，SM-F123制冰機購自SANYO;Multiskan全自動酶標儀購自ThermoFisher;低速離心機購自中佳;FRESCO17高速低溫離心機購自Thermo。

三、研究方法

1.RNA的提取

采用BiooPureTMRNAIsolationReagent法提取總RNA，紫外分光光度計測定波長260～280nm處的吸光度，計算OD260/280，鑒定RNA純度。并隨機抽取幾對樣品的癌組織及癌旁正常組織RNA進行核酸電泳，結果顯示RNA的量是相對準確可信的。

2.實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）檢測lnc-SERTAD1-1的表達

提取總RNA后定量，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。lnc-SERTAD1-1引物，上游5-TTTGGGACTTTCGGAGCAG-3，下游5-GACTTCAGGGCAATAGGA-3;β-actin引物，上游5-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3，下游5-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3。qRTPCR結束后用2-△Ct法處理實驗數(shù)據(jù)，其中，中位數(shù)及以上（≥0.000970）為高表達，中位數(shù)以下（<0.000970）則為低表達。

3.細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染及慢病毒感染靶細胞構建細胞系

應用GeneCopoeiaLentiPacHIV慢病毒表達系統(tǒng)按實際說明書進行實驗操作，將含有目的基因lnc-SERTAD1-1過表達的質(zhì)粒及含有空白載體質(zhì)粒分別與轉(zhuǎn)染試劑混合，得到2種試劑混合液，通過轉(zhuǎn)染，制備并收集對應的病毒液。采取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法將2種病毒液分別感染靶細胞HCT15，構建含有目的基因lnc-SERTAD1-1過表達的HCT15（HO）及含有空載體質(zhì)粒的HCT15（HOC），最后通過藥物篩選去除未穩(wěn)定轉(zhuǎn)染成功的HCT15，最終得到實驗所需的細胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，得到HOC及HO繼續(xù)培養(yǎng)細胞并提取細胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA行qRT-PCR驗證，實驗重復4次，明確HO過表達lnc-SERTAD1-1。

4.平板克隆形成實驗

將穩(wěn)轉(zhuǎn)成功并經(jīng)藥物篩查的2種細胞HO及HOC以200個/孔接種于6孔板中，每種細胞3個副孔，置于37℃、5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)14d后，去上清，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，4%多聚甲醛溶液固定15min，0.1%結晶紫溶液染色20min，染色后對肉眼可見的克隆團進行計數(shù)，計算克隆形成率（克隆形成率=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%），實驗重復6次。

5.細胞遷移實驗（Transwell）

將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染成功并經(jīng)藥物篩查的2種細胞HO及HOC消化并適度稀釋，用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞密度。將200μl（5×104個）細胞懸液接種于小室上層，將600μl含20%血清的RPMI1640培養(yǎng)基加至小室下層。置于37℃、5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，取出小室，用PBS洗2～3次，用棉簽擦除小室膜上層未穿過膜的細胞，用4%多聚甲醛溶液固定20min，室溫干燥小室，0.1%結晶紫染色30min，用干凈棉簽再次擦除未穿過小室的小室上層細胞，用流動水沖洗小室上多余的結晶紫，室溫干燥小室。使用100倍倒置顯微鏡，隨機選擇5個視野拍照，然后計算細胞數(shù)，實驗重復5次。

6.蛋白免疫印跡法

將穩(wěn)轉(zhuǎn)成功并經(jīng)藥物篩查后的2種細胞HO及HOC傳代于6孔板中，每種細胞3個復孔，置于37℃、5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞生存狀態(tài)良好，融合度達70%～80%時，分別提取這2種細胞的蛋白，按蛋白免疫印跡法常規(guī)操作步驟驗證下游蛋白SERTAD1在HOC和HO的表達水平，實驗重復4次。

四、統(tǒng)計學處理

運用SPSS19.0、GraphPadPrism8.0處理實驗結果，并進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的定量資料用表示，組間比較采用t檢驗，方差不齊采用校正t檢驗;非正態(tài)分布的定量資料用M（P25，P75）表示，組間比較采用MannWhitneyU檢驗。lnc-SERTAD1-1在癌組織與癌旁正常組織中的表達水平比較采用符號秩和檢驗;lnc-SERTAD1-1表達水平與患者臨床病理特征之間的相關性用χ2檢驗。根據(jù)lnc-SERTAD1-1的表達水平中位數(shù)分為lnc-SERTAD1-1低表達和lnc-SERTAD1-1高表達，<0.000970為低表達組，≥0.000970為高表達組。計算結直腸癌患者總生存期（OS）及無病生存期（DFS），采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，logrank檢驗對比生存曲線，分析lnc-SERTAD1-1表達對結直腸癌患者生存率的影響。采用多因素Cox比例風險模型（進入法）評估lnc-SERTAD1-1的表達水平及不同臨床病理特征與患者預后的關系，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、lnc-SERTAD1-1在癌組織與癌旁正常組織中的表達水平

采用qRT-PCR檢測lnc-SERTAD1-1的表達水平。lnc-SERTAD1-1在結直腸癌組織中的表達水平低于癌旁正常組織，比較差異有統(tǒng)計學意義（Z=-5.188，P<0.001），見圖1。73.6%（92/125）的樣品檢測到lnc-SERTAD1-1在癌組織中的表達低于配對的癌旁正常組織，見圖2。

二、lnc-SERTAD1-1在CCD-18Co與HCT15中的表達

采用qRT-PCR檢測lnc-SERTAD1-1在CCD-18Co與HCT15中的表達水平，結果提示lnc-SERTAD1-1在CCD-18Co中的表達高于HCT15（n=4，t=4.565，P=0.004），見圖3。

低表達為lnc-SERTAD1-1在癌組織中的表達比配對的癌旁正常組織低的例數(shù);高表達為lnc-SERTAD1-1在癌組織中的表達比配對的癌旁正常組織高的例數(shù)

三、lnc-SERTAD1-1的表達與結直腸癌臨床病理特征的關系

125例結直腸癌患者中l(wèi)nc-SERTAD1-1低表達樣本（2-△Ct<0.000970）62例（49.6%）。直腸癌患者、腫瘤直徑<5cm者及大體分型為腫塊型者，其lnc-SERTAD1-1的表達水平越低，見表1。

四、結直腸癌患者不同臨床病理特征與生存率的多因素分析

采用Cox比例風險模型進行多因素預后分析，結果顯示，腫瘤大體分型為環(huán)窄型、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期是結直腸癌患者術后OS和DFS的獨立危險因素;年齡>60歲是結直腸癌患者術后OS的獨立危險因素，但不是結直腸癌DFS的獨立危險因素;lnc-SERTAD1-1高表達則是結直腸癌患者OS及DFS的獨立保護因素，見表2。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，125例結直腸癌患者的1年生存率、3年生存率、5年生存率分別為96.0%、82.4%、67.2%，見圖4A。lnc-SERTAD1-1低表達組與高表達組1年生存率分別為93.5%、98.4%，3年生存率為69.4%、95.2%，5年生存率為50.0%、82.5%，log-rank檢驗提示，lnc-SERTAD1-1低表達組的生存率比lnc-SERTAD1-1高表達組低（P<0.001），見圖4B。

五、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后lnc-SERTAD1-1在HOC與HO中的表達

采用qRT-PCR驗證穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的HOC和HO中l(wèi)nc-SERTAD1-1的表達，結果提示lnc-SERTAD1-1在HO中的表達高于HOC（n=4，t'=-12.019，P<0.05），見圖5。

六、lnc-SERTAD1-1對結直腸癌細胞增殖的作用

平板克隆實驗檢測lnc-SERTAD1-1對結直腸癌細胞克隆形成的影響。在HO中，細胞克隆形成數(shù)低于HOC（n=6，t'=-2.569，P=0.039），見圖6。結果提示lnc-SERTAD1-1抑制結直腸癌細胞克隆形成。

七、lnc-SERTAD1-1對結直腸癌細胞的遷移作用

使用Transwell小室檢測HO體外遷移能力。對lnc-SERTAD1-1過表達后，觀察到HO穿過Transwell小室的數(shù)量較HOC少（n=5，t=7.120，P<0.001），見圖7。實驗結果表明，lnc-SERTAD1-1抑制結直腸癌細胞的體外遷移。

八、蛋白免疫印跡法檢測下游蛋白SERTAD1在HOC與HO中的表達

多次行蛋白免疫印跡法檢測下游蛋白SERTAD1在HOC與HO中的表達水平，結果提示，SERTAD1在HO中的表達高于HOC（n=4，t=-108.530，P<0.001），見圖8。

討論

lncRNA可參與腫瘤的增殖、分化、浸潤及轉(zhuǎn)移等過程，可發(fā)揮促癌或抑癌作用。相關研究表明，SERTAD1是一種癌基因，在營養(yǎng)不良和饑餓條件下可促進腫瘤發(fā)生和程序性細胞死亡（PCD）[11]。Mongre等[12]報道SERTAD1在大多數(shù)癌癥（例如浸潤性乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、畸胎瘤、骨髓瘤和胰腺導管癌）中起著潛在的致癌作用。雖然上述研究表明SERTAD1發(fā)揮癌基因作用，但也有其他研究表明其在不同類型的癌癥中發(fā)揮相反的作用。Xi等[13]發(fā)現(xiàn)，在結直腸癌中SERTAD1的表達是降低的，與SERTAD1作為潛在的腫瘤抑制因子的功能一致。

本研究顯示，結直腸癌組織中l(wèi)nc-SERTAD1-1的表達量較相應的癌旁正常組織低，lnc-SERTAD1-1在腸癌細胞中的表達亦低于正常腸黏膜細胞。這與Xi等[13]研究結果一致，提示lnc-SERTAD1-1與SERTAD1可能存在正相關關系，調(diào)控該基因的表達。分析該組病例中l(wèi)nc-SERTAD1-1與其臨床病理特征的關系，發(fā)現(xiàn)腫瘤部位、直徑及腫瘤的大體分型與結直腸癌中l(wèi)nc-SERTAD1-1的表達相關，結直腸癌中l(wèi)nc-SERTAD1-1的低表達以直腸癌、腫瘤直徑<5cm、腫瘤大體分型為腫塊型者更為多見，并且lnc-SERTAD1-1的高表達是結直腸癌OS的獨立保護因素，也是結直腸癌患者術后DFS的獨立保護因素。隨后的人群預后關聯(lián)分析提示lnc-SERTAD1-1高表達是結直腸癌患者OS、DFS的獨立保護因素，明確了lnc-SERTAD1-1對結直腸癌預后的意義。鑒于此，我們進一步行體外實驗，平板克隆實驗結果顯示在HCT15中，HOC的細胞克隆形成率低于HOC;細胞遷移實驗結果顯示HOC的遷移能力弱于HOC。以上體外功能實驗結果顯示，lnc-SERTAD1-1過表達抑制了結直腸癌細胞的增殖和遷移，提示lnc-SERTAD1-1可能對結直腸癌起抑癌作用。

本研究為了驗證lnc-SERTAD1-1與SERTAD1之間可能存在正相關的關系，對HOC及HO進行了轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平的檢測，結果提示，lnc-SERTAD1-1和下游蛋白SERTAD1在HO中的表達量均高于HOC，提示質(zhì)粒成功導入HCT15中，且lnc-SERTAD1-1與SERTAD1存在正相關關系。目前，有關lnc-SERTAD1-1與結直腸癌關系的研究極少，lnc-SERTAD1-1在結直腸癌中的分子作用機制的研究更為罕見。本研究結果提示了lnc-SERTAD1-1可抑制結直腸癌細胞的增殖與遷移，其在結直腸癌中作為一種抑癌分子參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移是有可能的。

本研究尚存在一些不足，lnc-SERTAD1-1與臨床病理特征的相關分析數(shù)據(jù)僅來源于單中心，應增加樣本量，尋求多中心多地區(qū)合作，進行更具代表性的調(diào)查研究。本研究初步驗證了lnc-SERTAD1-1對結直腸癌的抑癌作用，為深入研究結直腸癌發(fā)病及進展機制提供了理論依據(jù)，有望用于指導臨床治療及術后隨訪，但更深入的作用機制及臨床應用尚待進一步研究。