醬香型白酒機(jī)械化制曲發(fā)酵細(xì)菌群落的演替

左乾程，黃永光,*，郭 敏，胡 峰，尤小龍，程平言

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2.貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州 習(xí)水 564600）

白酒是華夏民族上千年傳承的傳統(tǒng)民族特色飲料酒，其釀造工藝別具一格，酒體風(fēng)味豐富而獨(dú)特，在國際上美譽(yù)度高，與白蘭地、威士忌、伏特加、朗姆酒、金酒并列為世界六大蒸餾酒[1]。中國白酒種類繁多，依據(jù)口感及風(fēng)格差異可分為醬香型、濃香型、清香型、米香型、兼香型、芝麻香型、鳳香型、特香型、豉香型、藥香型、老白干香型[1]。其中以茅臺(tái)為代表的醬香型白酒是中國白酒中釀造工藝最為復(fù)雜、最具特色以及最受消費(fèi)者喜愛的白酒，其復(fù)雜的釀造工藝可概括為“高溫制曲、高溫堆積發(fā)酵、高溫餾酒、長期貯存”等[2]，高溫制曲是醬香型白酒釀造工藝中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，高溫大曲的質(zhì)量直接決定著醬香型白酒的產(chǎn)量及質(zhì)量。

高溫大曲是醬香型白酒釀造中的唯一糖化發(fā)酵劑，是利用純小麥作為原料，添加母曲自然接種、培養(yǎng)而成，制曲過程曲胚發(fā)酵溫度高達(dá)60～65 ℃，通過高溫發(fā)酵、培菌實(shí)現(xiàn)制曲過程微生物的演替和酶的有效積累。傳統(tǒng)的高溫大曲制作主要采用人工操作，存在生產(chǎn)環(huán)境差、勞動(dòng)強(qiáng)度大、生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)效率低等缺點(diǎn)，加之由于人工踩曲的開放性，必然會(huì)受到操作因素的影響，使得大曲質(zhì)量難以穩(wěn)定。近年來，隨著傳統(tǒng)釀造技術(shù)的不斷發(fā)展，高溫大曲機(jī)械化制曲進(jìn)程也在不斷推進(jìn)。高溫大曲機(jī)械化制曲工藝如圖1所示，通過模仿人工腳掌踩曲動(dòng)作，采用獨(dú)創(chuàng)氣缸兩階段多次踩曲技術(shù)（仿生踩曲），代替了傳統(tǒng)人工腳掌踩曲的操作，大大提高了高溫大曲質(zhì)量穩(wěn)定性及生產(chǎn)效率，降低了勞動(dòng)強(qiáng)度及生產(chǎn)成本。機(jī)械化制曲過程除采用仿生壓曲機(jī)代替?zhèn)鹘y(tǒng)人工腳掌踩曲操作外，其他條件（如用曲及其比例、制曲原料、工藝操作及發(fā)酵參數(shù)控制等）皆與傳統(tǒng)制曲一致，雖然機(jī)械化與傳統(tǒng)人工踩出的曲在外觀形狀及松緊程度上并無明顯差異，但機(jī)械化壓制的曲塊與傳統(tǒng)人工踩制曲塊在發(fā)酵過程是否在微生物的生長、微生物菌群結(jié)構(gòu)的差異，以及機(jī)械化制曲與傳統(tǒng)制曲發(fā)酵過程微生物群落演替有無差異，均成為機(jī)械化制曲能否代替?zhèn)鹘y(tǒng)人工制曲的關(guān)鍵問題。

圖1 機(jī)械化制曲工藝操作流程Fig.1 Flow chart for the mechanized production of high-temperature Daqu

眾所周知，醬香型高溫大曲與其他香型白酒釀造大曲的區(qū)別不只是制曲溫度更高，更是曲塊中微生物群落結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性、酶類的豐富性及風(fēng)味物質(zhì)的復(fù)雜性。高溫大曲的這些特性直接決定醬香白酒的產(chǎn)量和質(zhì)量，而這些特性是由制曲過程的微生物群落結(jié)構(gòu)及其演替所決定的。高溫大曲發(fā)酵過程的微生物菌群結(jié)構(gòu)包括酵母菌、細(xì)菌、霉菌及放線菌，其中細(xì)菌在白酒發(fā)酵過程中具有產(chǎn)酶及產(chǎn)香等功能，其代謝產(chǎn)生豐富的風(fēng)味物質(zhì)決定醬香型白酒的風(fēng)格及品質(zhì)[3-5]，因此，系統(tǒng)解析高溫大曲機(jī)械化制曲發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，對(duì)了解制曲過程發(fā)酵機(jī)理、調(diào)控大曲生產(chǎn)及提高大曲和白酒質(zhì)量具有重要意義。目前已經(jīng)對(duì)清香大曲[6]、兼香型大曲[7]發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。對(duì)醬香型大曲傳統(tǒng)制曲發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也進(jìn)行了研究[8]，但其機(jī)械化制曲發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以及其與傳統(tǒng)制曲發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有何差別尚不清晰，在一定程度上制約了醬香型白酒機(jī)械化制曲的發(fā)展，因此，本研究采用高通量測序技術(shù)及數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)高溫大曲機(jī)械化制曲發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其演替進(jìn)行解析，并分析環(huán)境因子對(duì)大曲發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的調(diào)控作用，對(duì)了解機(jī)械化制曲過程發(fā)酵機(jī)理、調(diào)控機(jī)械化大曲生產(chǎn)具有重要意義，以期推動(dòng)醬香型白酒機(jī)械化制曲產(chǎn)業(yè)的創(chuàng)新發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品采自貴州茅臺(tái)集團(tuán)XJ公司醬香機(jī)械化制曲車間，根據(jù)生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)表明，大曲入房、第1次翻曲、第2次翻曲及大曲出房為發(fā)酵關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)及關(guān)鍵工藝控制點(diǎn)，因此，選取曲塊入房（發(fā)酵0 d）、第1次翻曲（發(fā)酵7 d）、第2次翻曲（發(fā)酵14 d）、曲塊出房（發(fā)酵40 d）為采樣時(shí)間點(diǎn)；每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)采集曲房靠門、中間、靠窗的上、中、下三層大曲樣品各500 g，進(jìn)行粉碎后再充分混勻以消除取樣誤差，得到一個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)的樣品，采集完成后立即進(jìn)行DNA提取及相關(guān)理化指標(biāo)的測定。

DNA Marker 寶生物工程有限公司；磷酸鹽緩沖液、引物合成 生工生物工程（上海）股份有限公司；E.Z.N.A.Soil DNA Kit 美國Omega BioTek公司；異丙醇（分析純）、TAE緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖 南京生興生物技術(shù)有限公司；Goldview染料 上海賽百盛有限公司；rTaqDNA聚合酶試劑盒北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、紫外分光光度計(jì) 美國Thermo Fisher Scientific公司；高壓蒸汽滅菌鍋 致徽（廈門）儀器有限公司；旋渦混合器 北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；pH計(jì)德國Sartorius公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；電泳儀 北京六一儀器廠；凝膠成像儀 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理及DNA提取[9-12]

分別稱取1.1節(jié)各取樣時(shí)間點(diǎn)采取的混合曲粉15 g于無菌離心管中，加入30 mL 0.1 mol/L無菌磷酸鹽緩沖液及5 顆玻璃珠，渦旋振蕩8 min，400 r/min離心6 min，收集上清液，用磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀，渦旋振蕩6 min，400 r/min離心6 min，吸取上清液，繼續(xù)用磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀，渦旋振蕩4 min，400 r/min離心6 min，收集上清液。將3 次收集的上清液充分混勻后12 000 r/min離心5 min，棄去上清液，收集細(xì)胞沉淀。預(yù)處理完成后，參照E.Z.N.A.?Soil DNA Kit的操作說明書進(jìn)行樣品總DNA的提取。

1.3.2 PCR擴(kuò)增及Illumina MiSeq測序

應(yīng)用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）擴(kuò)增V3和V4高變區(qū)，引物兩端帶有12 個(gè)隨機(jī)核苷酸堿基（Barcode）作為樣品標(biāo)簽。PCR體系及反應(yīng)條件參考黃蘊(yùn)利等[13]的方法，并適當(dāng)修改。PCR體系：10×Buffer 4 μL，dNTPs 2 μL，正反應(yīng)物各0.8 mL，rTaqDNA聚合酶0.2 μL，ddH2O 12.2μL，共計(jì)20 μL反應(yīng)體系。PCR條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，27 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。凝膠電泳：1%瓊脂糖凝膠，核酸染料（Gengreen），電壓90 V，電泳時(shí)間40 min。高通量測序在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。

1.3.3 理化指標(biāo)測定

大曲樣品溫度的測定：采樣的同時(shí)將溫度計(jì)插入取樣點(diǎn)附近，保持1 min左右，待讀數(shù)穩(wěn)定后，記錄溫度計(jì)溫度數(shù)據(jù)。水分、酸度的測定參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[14]。

1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

采用Microsoft Office Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，IBM SPSS Statistics進(jìn)行顯著性分析，R語言繪制群落柱形圖及相關(guān)性熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性分析

單個(gè)樣品的微生物α多樣性通常用Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)表征，Shannon指數(shù)一般代表微生物群落中物種的多少[15-16]，Chao1指數(shù)一般用來估計(jì)微生物群落的豐富度[17]。如表1所示，機(jī)械化大曲發(fā)酵過程中細(xì)菌物種多樣性與豐富度呈波動(dòng)式變化，在大曲進(jìn)入曲房至第1次翻曲階段呈上升趨勢，第1次翻曲至第2次翻曲階段呈下降趨勢，第2次翻曲到出曲房時(shí)出現(xiàn)緩慢上升。這種變化趨勢主要與曲胚中的理化因子有關(guān)，在發(fā)酵前期（大曲入房到第1次翻曲階段），曲培溫度及水分適宜細(xì)菌生長，所以該階段細(xì)菌物種多樣性與豐富度增加，發(fā)酵中期（第1次翻曲至第2次翻曲之間），曲胚的平均溫度較高，高溫淘汰了部分不耐熱細(xì)菌，致使細(xì)菌物種多樣性與豐富度降低；第2次翻曲過后，曲胚溫度較之前有所降低，部分細(xì)菌又重新在大曲上生長，使得細(xì)菌物種多樣性與豐富度出現(xiàn)部分回升。

表1 樣本細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Table 1 α-Diversity of bacterial community

2.2 機(jī)械化制曲發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

機(jī)械化制曲發(fā)酵過程中共檢出9 個(gè)菌門，其中平均相對(duì)豐度大于1%的僅有Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria及Cyanobacteria（圖2）。大曲入房時(shí)，F(xiàn)irmicutes和Proteobacteria菌門在機(jī)械化大曲中占主導(dǎo)地位，平均相對(duì)豐度＞20%。這與醬香高溫大曲傳統(tǒng)制曲發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)一致[8]，張雙燕等[6]通過高通量測序分析北京清香大曲發(fā)酵過程也發(fā)現(xiàn)這2 個(gè)門為其主要細(xì)菌種群，李申奧[7]通過高通量測序分析北京清香兼香型大曲發(fā)酵過程同樣發(fā)現(xiàn)這2 個(gè)門是主要細(xì)菌種群；同時(shí)，F(xiàn)irmicutes及Proteobacteria也是芝麻香型高溫大曲[18]以及濃香型大曲[19]中的主要細(xì)菌種群，說明這些細(xì)菌是中國白酒大曲中的關(guān)鍵微生物。此外，圖2表明，第1次翻曲之后，F(xiàn)irmicutes及Proteobacteria在機(jī)械化大曲中占主導(dǎo)地位（平均相對(duì)豐度＞20%），且Firmicutes占有絕對(duì)優(yōu)勢，平均相對(duì)豐度為75.35%。第1次翻曲之后，機(jī)械化大曲中變成了Firmicutes占主導(dǎo)地位，相對(duì)豐度高達(dá)95.66%～97.79%。該結(jié)果與清香型大曲[6]、兼香型大曲[7]發(fā)酵過程微生物的研究結(jié)論一致，表明大曲發(fā)酵過程中，細(xì)菌門水平群落多樣性降低，微生態(tài)結(jié)構(gòu)由多菌系演替為單一的厚壁菌門為主導(dǎo)的發(fā)酵模式，是大曲發(fā)酵門水平微生態(tài)變化的規(guī)律性模式。

圖2 大曲樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)（門水平）Fig.2 Bacterial community structure in Daqu samples at phylum level

機(jī)械化制曲發(fā)酵過程中共檢出84 個(gè)細(xì)菌屬，其中優(yōu)勢細(xì)菌屬（至少在一個(gè)樣品中相對(duì)豐度大于1%） 為14 個(gè)（圖3），包括Pantoea、Rhizobium、Lactobacillus、Weissella、Bacillus、Oceanobacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Thermoactinomyces、Staphylococcus、Enterobacter、Saccharopolyspora、Pediococcus和Tepidimicrobium。大曲進(jìn)入曲房（發(fā)酵0 d）時(shí)，大曲中Pantoea相對(duì)豐度最高（27.16%），其次是Rhizobium（21.66%）、Bacillus（10.33%）、Thermoactinomyces（4.78%）、Lentibacillus（4.25%）、Kroppenstedtia（3.27%）、Enterobacter（1.71%）及Staphylococcus（1.71%）。Pantoea、Lentibacillus及Kroppenstedtia均被檢出于多種大曲中[3,5,7-8]，但其在釀酒中的功能尚不清晰；Rhizobium被發(fā)現(xiàn)于小麥中，對(duì)小麥的生長具有促進(jìn)作用[20]，推測該菌屬來源于制曲原料小麥，但其在釀酒中的功能尚未見報(bào)道。Bacillus是醬香型白酒發(fā)酵過程中主要的功能細(xì)菌種群，除了可以代謝淀粉酶、蛋白酶等多種水解酶外，還可代謝產(chǎn)乙偶姻、4-甲基吡嗪等風(fēng)味物質(zhì)[21-23]，對(duì)醬香型白酒的風(fēng)味品質(zhì)具有重要貢獻(xiàn)[24-25]。Staphylococcus常被發(fā)現(xiàn)于香腸、火腿等發(fā)酵食品中，可產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味[26]。第1次翻曲（發(fā)酵7 d）時(shí)，Pantoea、Lentibacillus及Kroppenstedtia平均相對(duì)豐度均下降至1%以下，推測該部分菌屬不耐熱或不耐酸，曲溫及酸度升高導(dǎo)致這部分菌屬相對(duì)豐度下降。而Bacillus、Lactobacillus、Weissella平均相對(duì)豐度上升，其中Bacillus平均相對(duì)豐度最高（40.76%），Lactobacillus、Weissella可代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸類物質(zhì)，是造成大曲發(fā)酵前7 d酸度顯著升高的主要原因。大曲中酸度升高一方面可以抑制不耐酸雜菌的生長繁殖，另一方面乳酸、乙酸等物質(zhì)也為白酒中風(fēng)味物質(zhì)的合成提供前體[27-28]。此外，大曲在高溫階段維持一段時(shí)間，一方面可以淘汰不耐高溫、不耐酸的雜菌，另一方面也為醬香型白酒高溫發(fā)酵篩選功能微生物。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，到第2次翻曲（發(fā)酵14 d）時(shí)，Lactobacillus和Weissella平均相對(duì)豐度下降至低于1%，是造成發(fā)酵后期酸度下降的主要原因。Bacillus平均豐度也降低至11.07%，而Lentibacillus、Pediococcus及Oceanobacillus平均相對(duì)豐度顯著升高，均超過或接近10%。大曲出房（發(fā)酵40 d）時(shí)，Lentibacillus平均相對(duì)豐度最高（39.53%），其次為Staphylococcus（18.24%）、Kroppenstedtia（15.58%）、Bacillus（15.53%）、Oceanobacillus（4.70%）及Rhizobium（1.19%）。

圖3 大曲樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)（屬水平）Fig.3 Bacterial community structure in Daqu samples at genus level

大曲入房（0 d）時(shí)，大曲塊中Pantoea、Rhizobium及Bacillus為主要優(yōu)勢菌屬（平均相對(duì)豐度＞10%）。第1次翻曲（7 d）時(shí)，大曲塊中主要優(yōu)勢菌屬為Bacillus、Rhizobium及Lactobacillus，平均相對(duì)豐度＞10%。第2次翻曲（14 d）時(shí)，大曲塊中Lentibacillus、Oceanobacillus及Bacillus為主要優(yōu)勢菌屬，平均相對(duì)豐度＞10%。大曲塊出房（40 d）時(shí)，大曲塊中Lentibacillus、Staphylococcus、Kroppenstedtia及Bacillus菌屬平均相對(duì)豐度大于10%，是主要優(yōu)勢菌屬。其中，Bacillus在整個(gè)發(fā)酵過程中平均相對(duì)豐度都大于10%，是機(jī)械化制曲整個(gè)發(fā)酵過程中的主要優(yōu)勢菌。同時(shí)，Pantoea、Rhizobium、Bacillus、Rhizobium、Lactobacillus、Lentibacillus、Oceanobacillus、Staphylococcus、Kroppenstedtia也是醬香型白酒發(fā)酵過程中的主要優(yōu)勢菌[29-31]，表明這些菌屬在制曲與制酒過程存在明顯的菌群遷徙，生態(tài)結(jié)構(gòu)演替。

2.3 機(jī)械化制曲與傳統(tǒng)制曲發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)比分析

郭敏[8]采用高通量測序?qū)︶u香型白酒傳統(tǒng)制曲發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，共檢出82 個(gè)細(xì)菌屬，稍低于機(jī)械化制曲發(fā)酵過程的84 個(gè)細(xì)菌屬，如圖4a所示，其中有75 個(gè)細(xì)菌屬為傳統(tǒng)制曲和機(jī)械化制曲發(fā)酵過程共有細(xì)菌屬，占傳統(tǒng)制曲發(fā)酵過程總細(xì)菌屬數(shù)的91.46%，表明機(jī)械化制曲與傳統(tǒng)制曲發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差別不大。此外，傳統(tǒng)制曲發(fā)酵過程的優(yōu)勢細(xì)菌屬（至少在一個(gè)樣品中相對(duì)豐度大于1%）也是14 個(gè)，包括Pantoea、Rhizobium、Lactobacillus、Weissella、Bacillus、Oceanobacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Thermoactinomyces、Staphylococcus、Enterobacter、Saccharopolyspora、Leuconostoc和Pseudomonas，其中Pantoea（機(jī)械化制曲中平均相對(duì)豐度為6.92%，傳統(tǒng)曲為7.04%，下述皆為平均相對(duì)豐度）、Rhizobium（機(jī)械化制曲為10.14%，傳統(tǒng)曲為10.02%）、Lactobacillus（機(jī)械化制曲為1.76%，傳統(tǒng)曲為1.59%）、Weissella（機(jī)械化制曲為3.94%，傳統(tǒng)曲為3.76%）、Bacillus（機(jī)械化制曲為19.10%，傳統(tǒng)曲為17.67%）、Oceanobacillus（機(jī)械化制曲為3.78%，傳統(tǒng)曲為2.74%）、Lentibacillus（機(jī)械化制曲為25.14%，傳統(tǒng)曲為27.25%）、Kroppenstedtia（機(jī)械化制曲為5.69%，傳統(tǒng)曲為5.31%）、Thermoactinomyces（機(jī)械化制曲為3.94%，傳統(tǒng)曲為3.76%）、Staphylococcus（機(jī)械化制曲為7.36%，傳統(tǒng)曲為6.91%）、Enterobacter（機(jī)械化制曲為0.43%，傳統(tǒng)曲為0.56%）、Saccharopolyspora（機(jī)械化制曲為1.01%，傳統(tǒng)曲為1.28%）12 個(gè)細(xì)菌屬為機(jī)械化制曲與傳統(tǒng)制曲發(fā)酵過程共有優(yōu)勢菌（圖4b），占傳統(tǒng)制曲與機(jī)械化制曲發(fā)酵過程優(yōu)勢細(xì)菌屬的85.71%，且這些優(yōu)勢菌屬在兩種曲醅發(fā)酵過程中平均相對(duì)豐度較為接近，相差不大；表明機(jī)械化制曲與傳統(tǒng)制曲過程優(yōu)勢菌具有較高的相似性。與傳統(tǒng)制曲發(fā)酵過程相比，Pediococcus和Tepidimicrobium是機(jī)械制曲發(fā)酵過程特有的優(yōu)勢細(xì)菌屬，但其在釀酒過程中的功能尚不清晰（本課題組正在開展相關(guān)研究）；而Leuconostoc及Pseudomonas是傳統(tǒng)制曲過程特有的優(yōu)勢細(xì)菌屬，這兩種菌屬在釀酒中的功能尚不清晰（本課題組正在開展相關(guān)研究）。因此，目前的研究結(jié)果表明醬香型白酒高溫大曲機(jī)械化制曲發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)制曲過程具有很高的相似性，表明從發(fā)酵細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)上來說高溫大曲機(jī)械化制曲可以代替人工制曲，且與傳統(tǒng)制曲相比，機(jī)械化制曲不僅在很大程度上提高了大曲質(zhì)量穩(wěn)定性及生產(chǎn)效率，大幅降低勞動(dòng)強(qiáng)度及生產(chǎn)成本，還能避免工人在為惡劣的環(huán)境下操作，對(duì)推動(dòng)醬香型白酒行業(yè)的機(jī)械化與現(xiàn)代化發(fā)展具有促進(jìn)作用。

圖4 機(jī)械制曲與傳統(tǒng)制曲發(fā)酵細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)比Fig.4 Comparison of the structure of bacterial community between mechanical and traditional Daqu-making processes

2.4 環(huán)境因子對(duì)機(jī)械化曲胚中細(xì)菌生態(tài)結(jié)構(gòu)多樣性的影響

環(huán)境因子對(duì)微生物的生命及其行為具有較強(qiáng)的影響，進(jìn)而調(diào)控微生物在大曲發(fā)酵過程中的群落結(jié)構(gòu)及演替。如圖5a所示，冗余分析（redundancy analysis，RDA）結(jié)果顯示大曲溫度、水分及酸度對(duì)微生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有重要影響，第1次翻曲時(shí)，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主要受溫度及水分影響，呈正相關(guān)，表明此時(shí)的曲醅溫度及水分比較適合大曲中細(xì)菌生長，第2次翻曲至出房時(shí)，大曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)基本不受溫度、水分及酸度等環(huán)境因子的影響，推測由于第2次翻曲過后曲醅水分、溫度及酸度變化不大，對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響不大，且經(jīng)過前期的條件淘汰了部分不能耐受高溫制曲條件的細(xì)菌，剩下的細(xì)菌能夠耐受高溫大曲的環(huán)境，這也是高溫制曲的目的，為后期高溫發(fā)酵篩選微生物。為揭示環(huán)境因子對(duì)優(yōu)勢細(xì)菌群落的影響，將14 個(gè)優(yōu)勢細(xì)菌屬（平均相對(duì)豐度＞1%）與發(fā)酵過程環(huán)境因子進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如圖5b所示，大曲優(yōu)勢細(xì)菌屬（平均相對(duì)豐度＞1%）受環(huán)境因子影響較大，Bacillus、Lactobacillus、Weissella、Pediococcus、Saccharopolyspora、Thermoactinomyces、Rhizobium、Oceanobacillus8 種優(yōu)勢菌群與大曲溫度呈正相關(guān)，其中Bacillus、Lactobacillus、Weissella等菌屬是醬香型白酒發(fā)酵過程中的主要功能微生物[29-33]，從該層面也論證了醬香型白酒高溫制曲的合理性。Thermoactinomyces、Tepidimicrobium、Pantoea、Rhizobium、Saccharopolyspora5 種菌屬與大曲水分呈正相關(guān)，而Bacillus、Lactobacillus、Weissella等主要功能菌屬則與大曲水分呈負(fù)相關(guān)，該結(jié)果表明機(jī)械化制曲發(fā)酵過程需控制水分不要太高，水分過高導(dǎo)致“燒曲”等異常情況發(fā)生，一方面又對(duì)Bacillus、Lactobacillus、Weissella等主要功能菌屬生長造成不利影響。此外，Bacillus、Lactobacillus、Weissella等主要功能菌屬與大曲酸度呈正相關(guān)，且Lactobacillus、Weissella等菌屬也是大曲發(fā)酵過程產(chǎn)酸的主要細(xì)菌。以上結(jié)果表明，高溫大曲發(fā)酵過程保持一個(gè)相對(duì)較高的溫度及酸度，既有利于Bacillus、Lactobacillus、Weissella等主要功能菌屬的生長，又能抑制不耐熱、不耐酸雜菌的生長。

圖5 發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與大曲理化因子相關(guān)性分析Fig.5 Correlation between bacterial community structure and physicochemical properties of Daqu samples during fermentation

3 結(jié) 論

本研究應(yīng)用高通量測序及數(shù)理分析方法對(duì)醬香型白酒機(jī)械化制曲發(fā)酵過程中的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，從機(jī)械化制曲發(fā)酵過程中共檢出9 個(gè)菌門，優(yōu)勢菌門為Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria及Cyanobacteria，且隨著發(fā)酵的進(jìn)行，細(xì)菌門水平群落多樣性降低，由多菌系生態(tài)結(jié)構(gòu)演替為單一的厚壁菌門為主導(dǎo)的發(fā)酵模式。機(jī)械化制曲發(fā)酵過程中共檢出84 個(gè)細(xì)菌屬，稍高于傳統(tǒng)制曲的82 個(gè)細(xì)菌屬；機(jī)械化制曲發(fā)酵過程優(yōu)勢細(xì)菌屬（至少在一個(gè)樣品中相對(duì)豐度大于1%）共14 個(gè)，包括Pantoea、Rhizobium、Lactobacillus、Weissella、Bacillus、Oceanobacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Thermoactinomyces、Staphylococcus、Enterobacter、Saccharopolyspora、Pediococcus和Tepidimicrobium，其中Pediococcus和Tepidimicrobium是機(jī)械制曲發(fā)酵過程特有的優(yōu)勢細(xì)菌屬，Leuconostoc及Pseudomonas是傳統(tǒng)制曲過程特有的優(yōu)勢細(xì)菌屬，表明機(jī)械化制曲與傳統(tǒng)制曲過程優(yōu)勢菌具有較高的相似性。通過優(yōu)勢菌與環(huán)境因子相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，主要功能細(xì)菌屬Bacillus、Lactobacillus及Weissella都與大曲制曲溫度呈正相關(guān)，與大曲酸度呈正相關(guān)，表明在機(jī)械化制曲過程中要合理科學(xué)控制相對(duì)較高的溫度酸度，這樣既有利于主要功能微生物的生長，又能抑制不耐熱、不耐酸雜菌的繁殖。本研究為推進(jìn)醬香型白酒機(jī)械化制曲發(fā)展提供了基礎(chǔ)理論和學(xué)科依據(jù)。

本研究從發(fā)酵細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)上說明醬香型白酒的機(jī)械化制曲可以代替人工制曲，且與傳統(tǒng)制曲相比，機(jī)械化制曲不僅在很大程度上提高了大曲質(zhì)量穩(wěn)定性及生產(chǎn)效率，大幅降低勞動(dòng)強(qiáng)度及生產(chǎn)成本，還能避免工人在惡劣的環(huán)境下操作，有利于白酒行業(yè)的機(jī)械化與現(xiàn)代化發(fā)展。