響應(yīng)面法優(yōu)化桑葚膏滋處方用量的研究

◎ 侯振源，劉欣娜，張 曌，向超群，田同漢，梁 偉

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076）

桑葚膏滋共四味藥，桑葚、山藥、龍眼肉和甘草。此方是在《慎齋遺書》和《民間方》中的桑葚膏，以及“玉液湯”和“歸脾湯”君藥功效的基礎(chǔ)上加入甘草而來。本方以“君臣佐使”為組方原理，選擇藥食同源的四味中藥，其方解如下[1]。桑葚甘，酸，寒。歸心、肝、腎經(jīng)。善滋陰補(bǔ)血，生津潤燥[2-3]，故用為君藥。用量為45～55 g。山藥肝補(bǔ)澀斂性平，善養(yǎng)陰益氣，補(bǔ)脾肺腎，為平補(bǔ)氣陰之要藥[4]，故用為臣藥。用量為15～25 g。龍眼肉甘、溫。歸心、脾經(jīng)。善補(bǔ)益心脾，養(yǎng)血安神[2]，故用為佐藥。用量為5～10 g。甘草甘、平。歸心、脾、胃經(jīng)。善補(bǔ)益和氣、和中緩急且調(diào)和諸藥[5]，故用為使藥。用量為2～10 g。現(xiàn)代研究表明該四味藥對人體機(jī)能尤其是在調(diào)節(jié)免疫方面有重要作用。

本試驗通過響應(yīng)面法，篩選最佳處方量。通過外觀、相對密度和不溶物檢查進(jìn)行膏滋質(zhì)量評價。本項目旨在研制一種調(diào)節(jié)免疫、養(yǎng)心安神的膏劑，并為桑葚的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑與儀器

1.1.1 試驗材料

桑葚、山藥、龍眼肉、甘草（購自哈爾濱市道外區(qū)三棵樹中藥材專業(yè)市場，經(jīng)專家鑒定為真）。

1.1.2 試驗試劑

蒸餾水（批號：20201118），蜂蜜（批號：20201019）。

1.1.3 試驗儀器

BSA萬分之一電子分析天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HH2電熱恒溫水浴鍋，天津因特萊斯儀器有限公司；GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SDHCB8E30-210電磁爐（鍋），浙江紹興蘇泊爾生活電器有限公司；TP-214分析天平，托利多儀器有限公司。

1.2 試驗內(nèi)容與方法

1.2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化處方用量

（1）響應(yīng)面試驗因素及水平設(shè)計。以A桑葚添加量（g）、B山藥添加量（g）、C龍眼肉添加量（g）、D甘草添加量（g）為4因素，以出膏率為響應(yīng)值。以臣藥山藥為中等劑量20 g，君藥用量且要高于臣藥用量1/3，佐使藥也要低于臣藥1/3，最后以桑葚50 g、山藥20 g、龍眼肉10 g、甘草5 g，為處方的基礎(chǔ)用量，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化用量。統(tǒng)一湯劑煎煮條件，試驗因素及水平設(shè)計如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平設(shè)計表

（2）試驗方法。以上述的因素水平為依據(jù)，進(jìn)行試驗方案的設(shè)計。運(yùn)用Design-Expert軟件設(shè)計試驗，并根據(jù)設(shè)計出的試驗方案進(jìn)行試驗[6]。

依據(jù)試驗方案，稱取相應(yīng)桑葚、山藥、龍眼肉、甘草的用量置于燒杯中，加入沒過藥材表面的水，浸泡60 min后，將藥材置于鍋中，加入藥材6倍的水，先武火煎煮，后小火煎煮，煎煮60 min后，過濾得煎煮液1，再次將藥材置于鍋中，加入6倍的水，煎煮60 min后，過濾得煎煮液2，混合煎煮液1和煎煮液2，靜置，沉淀藥渣。過濾并置于鍋中濃縮，濃縮至滴液在紙上無滲潤水跡。得到清膏，并計算出膏率。重復(fù)試驗方案，直至完成。

1.2.2 桑葚膏滋的制備

（1）桑葚膏滋的制備工藝。桑葚膏滋的制備工藝如圖1所示。

圖1 桑葚膏滋的制備工藝圖

（2）桑葚膏滋的制備方法。按處方比例稱取藥材，取適量的蜂蜜作為矯味劑。取5份處方用量藥材分別放于燒杯內(nèi)，各加水浸泡120 min。把浸泡之后的藥材放置于鍋中煎煮90 min，武火煮沸后文火加蓋慢煮，煎煮2次后，合并水煎液，靜置沉淀藥渣。將所得水煎液過濾后濃縮，濃縮至滴液在紙上沒有滲潤水跡的現(xiàn)象，即得5份清膏。選取無浮沫、死蜂等雜質(zhì)的優(yōu)質(zhì)蜂蜜，中火煉蜜。向清膏內(nèi)加入煉蜜，攪拌均勻，濃縮至滴液在紙上沒有滲潤水跡，冷卻之后即得成品。將膏滋分裝在潔凈干燥滅菌的大口容器中，待充分冷卻后加蓋密閉，防止水蒸氣冷凝后流回表面出現(xiàn)霉敗現(xiàn)象。貯藏于陰涼干燥處。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗

2.1.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

選擇A桑葚添加量（g）、B山藥添加量（g）、C龍眼肉添加量（g）、D甘草添加量（g）為4個影響因素，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗原理，進(jìn)行試驗因素及水平設(shè)計。根據(jù)確定的因素水平，各組藥材浸泡60 min，按條件進(jìn)行煎煮，以出膏率（Y）為響應(yīng)值，使用軟件Design-Expert8.0.6.1Trial進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。該試驗設(shè)計包含24個析因試驗和5個中心試驗，其中由4個影響因素所構(gòu)成的三維立體圖形的頂點為析因點，三維圖形的中心區(qū)域為零點，中心試驗重復(fù)5次以估計試驗誤差[7]。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果表

2.1.2 方程的建立與顯著性分析

采 用 Design-Expert10.0.7軟 件 對“2.1.1” 中的中心組合試驗設(shè)計和結(jié)果進(jìn)行多元回歸統(tǒng)計分析，影響因素經(jīng)過多元擬合得到回歸方程如下，Y=39.57+2.93×A+0.12×B+0.023×C+1.408×D-0.58×AB+0.32×AC+0.28×AD-0.17×BC-0.19×BD+0.19×CD+3.93×A2-2.49×B2-4.68×C2-5.12×D2。

統(tǒng)計分析結(jié)果得模型的P值＜0.01，模型的F值為4.91，表明模型具有顯著性，有統(tǒng)計學(xué)意義。方差來 源A、B、D、A2、B2、C2、D2的P值 均 ＜ 0.01，差異極顯著，AC、BD的P值＜0.05，均為重要的模型項，有統(tǒng)計學(xué)意義，證明各因素之間有一定交互影響；同時回歸方程的R2=0.789 3，說明清膏得率有78.93%的可能是由所選因素決定的，因此所確定的回歸方程可以作為準(zhǔn)確估計各影響因素和清膏得率的標(biāo)準(zhǔn)。

表3 響應(yīng)值二次模型的方差分析表

2.1.3 各因素交互影響響應(yīng)面分析

根據(jù)2.1.2得出的回歸方程，做出4個影響因素之間的響應(yīng)面圖，預(yù)測4個影響因素對出膏率的影響，結(jié)果如圖2～圖7所示。

由圖2可知，等高線呈圓形，說明桑椹添加量和山藥添加量的相互作用不顯著[8]。由圖3可知，等高線呈橢圓形，說明桑椹添加量和龍眼肉添加量的相互作用顯著。出膏率隨著桑葚和龍眼肉二者的添加量的增加，呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢。由圖4可知，等高線呈圓形，說明桑椹添加量和甘草添加量的相互作用不顯著。由圖5可知，等高線呈圓形，說明龍眼肉添加量和山藥添加量的相互作用不顯著。由圖6可知，等高線呈橢圓形，其軸線與坐標(biāo)軸之間有一定的角度，說明甘草添加量和山藥添加量的相互作用顯著。出膏率隨山藥添加量和甘草添加量的遞增，先增大后減小。由圖7可知，等高線呈圓形，說明甘草添加量和龍山肉添加量間的相互作用不顯著。

圖2 A，B因素對出膏率影響的3D曲面圖

圖3 A，C因素對出膏率影響的3D曲面圖

圖4 A，D因素對出膏率影響的3D曲面圖

圖5 B，C因素對出膏率影響的3D曲面圖

圖6 B，D因素對出膏率影響的3D曲面圖

圖7 C，D因素對出膏率影響的3D曲面圖

2.1.4 桑葚膏滋處方的最佳用量確定

根據(jù)上述確立的響應(yīng)面模型，通過Design-Expert10.0.7軟件得出桑葚膏滋處方用量最佳數(shù)值為桑葚用量53.68 g、山藥用量22.73 g、龍眼肉用量9.18 g、甘草用量7.75 g，預(yù)測出膏率最大為41.46%，為檢驗響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，同時又考慮到實際可操作性，將實際組合定的量，在以此條件進(jìn)行驗證試驗，出膏率為39.57%，與理論預(yù)測值近,說明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化處方用量可靠。

2.2 質(zhì)量檢查結(jié)果

成品膏滋外觀性狀較好，無異味，氣味清香，膏體粘稠，顏色黑亮，經(jīng)過一段時間并未出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象。供試品相對密度符合相對密度檢查標(biāo)準(zhǔn)。膏滋加熱水溶化靜置觀察無焦屑等異物，符合不溶物檢查標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

本試驗以桑葚為君藥，山藥為臣藥，龍眼肉為佐藥，甘草為使藥進(jìn)行配方。采用了響應(yīng)面法進(jìn)行篩方，確定了組方含量為桑葚53.68 g、山藥22.73 g、龍眼肉9.18 g、甘草7.75 g，此時出膏率為39.57%。所得膏滋湯為深紫色藥液，伴有獨(dú)特的香味。最后濃縮收膏得到暗紫色膏滋。進(jìn)行質(zhì)量檢查，結(jié)果表明本試驗所得膏滋無異味，膏體細(xì)膩、有光澤，口感較好，且稠度中等，無霉敗現(xiàn)象，無焦屑類不溶物，相對密度符合要求。