接智慧，周 巖，吳慧麗，鄭莉莉，李 萍，高 翔

(山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，泰安 271000)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer，EC)是全球范圍內(nèi)第二常見女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，也是導(dǎo)致婦科癌癥相關(guān)死亡的第三常見原因，其發(fā)病呈年輕化趨勢[1]。目前EC治療上存在較多限制，患者難以達(dá)到治愈效果[2]。探索EC的發(fā)病機制、尋找早診早治的潛在靶點，對于改善EC患者的預(yù)后極其重要。近年來，miRNA與腫瘤的關(guān)系是腫瘤學(xué)研究的熱點之一，其中最具有代表性的是miR-17-92基因簇，其由6種成熟的miRNA組成，研究已發(fā)現(xiàn)miR-17-92在多種惡性腫瘤中均異常表達(dá)[3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-92在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa、HEC-1A細(xì)胞系及EC組織中存在異常高表達(dá)，并與EC的臨床病理特征相關(guān)[4-5]，但其異常表達(dá)的調(diào)控機制不清?；騿幼訁^(qū)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)可影響基因的表達(dá)，SNP位點也是腫瘤易感性研究的優(yōu)先選擇對象[6]。既往研究表明，存在于miR-17-92基因啟動子區(qū)上的功能性單核苷酸多態(tài)性可能通過改變其表達(dá)，從而影響多種疾病的發(fā)生與預(yù)后[7-10]。目前，miR-17-92啟動子區(qū)基因多態(tài)性與EC易感性及預(yù)后的關(guān)系尚不明確。本研究通過檢測EC患者外周血DNA中miR-17-92啟動子區(qū)rs1813389A/G、rs9515692C/T的基因型，分析探討其與EC易感性及預(yù)后的關(guān)系，為EC高危人群的篩選和早期診斷提供新的分子靶點。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2004年4月至2019年4月在山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院行手術(shù)治療的398例EC患者為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理確診為EC；(2)術(shù)前未行放化療及內(nèi)分泌治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他部位腫瘤病史；(2)合并免疫系統(tǒng)疾?。?3)合并全身感染。按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期標(biāo)準(zhǔn):早期(Ⅰ～Ⅱ期)294例(73.9%)，晚期(Ⅲ～Ⅳ期)104例(26.1%)。組織學(xué)分類:I型312例(78.4%)、Ⅱ型86例(21.6%)。選取同期于我院健康體檢、婦科手術(shù)探查證實為良性疾病或由于子宮良性疾病行子宮切除的420例婦女為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均取得知情同意并簽署知情同意書。病例組及對照組人群的一般特征見表1。

表1 研究人群的一般特征

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取 采集病例組(術(shù)前)和對照組婦女靜脈血5mL，加入內(nèi)置有0.85mL枸櫞酸鈉的試管中，于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?周內(nèi)用蛋白酶K消化-飽和氯化鈉鹽析法[11]提取基因組DNA，-20℃冰箱保存。

1.2.2 rs1813389、rs9515692基因多態(tài)性檢測 采用聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶反應(yīng)(PCR-LDR)技術(shù)檢測所有研究對象rs1813389、rs9515692多態(tài)位點的基因型和等位基因頻率的分布，由上海捷瑞生物工程有限公司完成(http://www.generay.com.cn)。引物序列：rs1813389上游為5'-CCAGGGTAAGGCTCCATACAT-3'，下游為5'-AAAGCTTTTCTGACACTTTGAGTAGT-3'；rs9515692上游為5'-GGAAACAACCTGGAGGCTCTTCAA3'，下游為5'-TTTCCTCTAACCTGAACCCTGTCT-3',PCR-LDR擴增及兩個位點測序結(jié)果見圖1。

圖1 PCR-LDR檢測rs1813389、rs9515692位點基因型

1.2.3 隨訪 189例EC患者隨訪時間達(dá)5年以上，中位隨訪時間為58個月。采用電話或門診隨訪。隨訪終點事件為患者死亡或隨訪截止時間(2020年10月)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件。采用Hardy-Weinberg平衡檢驗對rs1813389、rs9515692兩個SNP位點基因分型及等位基因頻率分布進(jìn)行檢驗。病例組與對照組的年齡差異采用t檢驗，基因型和等位基因頻率分布比較采用χ2檢驗，以非條件logistic回歸方法計算表示相對風(fēng)險度的比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)。采用Kaplan-Meier法分析rs1813389、rs9515692兩個SNP位點不同基因分型患者5年的生存情況，并采用log-rank檢驗基因分型及等位基因之間的差異，采用Cox風(fēng)險比例模型分析患者預(yù)后生存的相關(guān)基因分型及等位基因。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般臨床資料 EC組患者的平均年齡(54.1±10.6)歲，對照組為(53.8±9.4)歲，兩組婦女的年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)檢驗，對照組rs1813389、rs9515692兩個位點的基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P=0.297，P=0.086)。表明本研究選取的樣本人群有代表性。兩個多態(tài)性位點基因型頻率與EC患者臨床特征之間的關(guān)系，見表2。

表2 miR-17-92啟動子多態(tài)性(rs1813389、rs9515692)與EC臨床病理學(xué)特征的關(guān)系[n(%)]

2.2 rs1813389、rs9515692基因多態(tài)性與EC發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系 rs1813389和rs9515692基因型分布見表3。結(jié)果表明，與AA基因型相比，攜帶rs1813389 GG基因型可顯著降低EC發(fā)病風(fēng)險(OR=0.49,95%CI=0.32～0.78,P=0.002)；攜帶G等位基因者EC的發(fā)病風(fēng)險明顯低于A等位基因攜帶者(OR=0.75,95%CI=0.62～0.91,P=0.005)。與CC基因型相比，攜帶rs9515692 TT基因型可顯著降低EC發(fā)病風(fēng)險(OR=0.53,95%CI=0.34～0.82,P=0.004)。攜帶C等位基因者EC的發(fā)病風(fēng)險明顯低于T等位基因攜帶者(OR=0.77,95%CI=0.63～0.94,P=0.010)。

表3 miR-17-92啟動子多態(tài)性(rs1813389、rs9515692)與EC發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系[n(%)]

2.3 rs1813389、rs9515692基因多態(tài)性與EC預(yù)后的關(guān)系 攜帶rs1813389 AA、AG、GG基因型的EC患者的平均OS分別為36、49、52個月，5年生存率分別為41.6%、70.2%和75%，經(jīng)Kaplan-Meier分析，AG或GG基因型患者的總生存率明顯高于AA基因型患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；而攜帶rs9515692基因型CC、CT、TT的EC患者平均OS分別為43、44、48個月，5年生存率分別為60.3%、57.1%、64.0%。經(jīng)Kaplan-Meier分析，rs9515692C/T多態(tài)性與EC患者生存率無關(guān)(P=0.812)，結(jié)果見圖2。進(jìn)一步校正預(yù)后影響因素(年齡、組織學(xué)類型、FIGO分級、肌層侵潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)后,經(jīng)Cox回歸多因素分析，結(jié)果顯示rs1813389 AG或GG基因型是EC患者預(yù)后的獨立影響因素(HR=0.49,95%CI=0.36～0.82,P=0.007；HR=0.29,95%CI=0.16～0.83,P=0.017)；然而，rs9515692C/T多態(tài)性對EC患者的預(yù)后無影響。這些結(jié)果提示rs1813389 A/G多態(tài)性可能在EC預(yù)后中起重要作用，結(jié)果見表4。

圖2 rs1813389、rs9515692不同基因型與EC患者生存的關(guān)系(Kaplan-Meier法)

表4 EC患者5年預(yù)后的多因素Cox分析

3 討 論

miRNA-17-92基因簇位于人類染色體13q31-32，C13orf25基因的第3個內(nèi)含區(qū)，可轉(zhuǎn)錄形成6種成熟的miRNA(miR-17、miR-18a、miR-19a、miR20a、miR-19b-1和miR-92a-1)[3]。研究證明,miRNA-17-92在多種惡性腫瘤中過表達(dá)，如卵巢癌[11]、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤[12]等，被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-92基因簇的成員在EC組織中異常表達(dá)[13-14]。前期研究發(fā)現(xiàn),miR-17-92基因簇在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa、HEC-1A細(xì)胞系和EC組織中存在異常表達(dá)[4-5]。這些研究表明，miR-17-92基因簇與EC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有望成為EC早期診斷和分子治療的靶點，但miR-17-92基因簇異常表達(dá)的機制尚不清楚。

單核苷酸多態(tài)性是指在基因組DNA序列中單個核苷酸替換而引起的多態(tài)性，是人類可遺傳變異中最常見的一種，而啟動子區(qū)SNP可影響基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致與之相關(guān)疾病的發(fā)生[15-16]。先前研究已證明了miR-17-92啟動子多態(tài)性與多種疾病易感性之間的聯(lián)系，Huang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-92基因簇啟動子rs9301654多態(tài)性可能與中國人群中缺血性腦卒中發(fā)病風(fēng)險降低有關(guān)。Wang等[7]報道,rs9515692 CT+TT基因型是系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性的保護(hù)因素。Sun等[9]發(fā)現(xiàn),miR-17-92基因簇啟動子的rs9588884和rs982873多態(tài)性可降低結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險，并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，rs9588884和rs982873兩個位點可分別導(dǎo)致miR-20a和miR-17的轉(zhuǎn)錄活性降低，而rs1813389與結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險無關(guān)。這與Huang等[10]在宮頸鱗癌中的研究一致，即rs1813389與宮頸癌的發(fā)生也無關(guān)。但本研究發(fā)現(xiàn),rs1813389和rs9515692基因多態(tài)性可能與降低EC發(fā)病風(fēng)險有關(guān)，這一結(jié)果與其在結(jié)直腸癌和宮頸鱗癌中的研究結(jié)果并不一致。原因可能是：(1)rs1813389可能僅與部分類型腫瘤的發(fā)病相關(guān)；(2)不同研究的樣本量不同，如實驗樣本量不夠大，產(chǎn)生Ⅱ型錯誤的可能性增加，可能導(dǎo)致假陰性的結(jié)論。進(jìn)一步對rs1813389和rs9515692兩個位點不同基因型多態(tài)性與EC患者的預(yù)后進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)攜帶rs1813389位點不同基因型與EC患者5年生存相關(guān)，結(jié)果顯示攜帶rs1813389的GG/AG基因型EC患者的OS明顯長于AA基因型，可作為EC患者預(yù)后的獨立影響因素。推測rs1813389和rs9515692可能通過降低miR-17-92家族成員的表達(dá)，從而影響EC的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后。因此認(rèn)為，rs1813389和rs9515692基因多態(tài)性可能成為EC早期診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)記物，深入對SNP位點功能研究將有助于證實本研究結(jié)果。

綜上所述，miR-17-92基因簇啟動子區(qū)rs1813389、rs9515692多態(tài)性可能是中國華北地區(qū)婦女子宮內(nèi)膜癌發(fā)病及預(yù)后的分子標(biāo)記物，也進(jìn)一步證實了miR-17-92基因簇的遺傳變異可能成為個體腫瘤研究的候選遺傳熱點。當(dāng)然，這一結(jié)論還需進(jìn)一步大樣本的人群研究，特別是前瞻性的研究證實。