林孌，史智萍，曹芳，潘雅娟，林巧燕，劉斌

(1.泉州師范學(xué)院 海洋與食品學(xué)院，福建 泉州 362000； 2.福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開發(fā)重點實驗室,福建 泉州 362000； 3.福建農(nóng)林大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

小球藻(Chlorella)是地球上最早的生命之一，是出現(xiàn)在20多億年前的一種普生性球形單細(xì)胞藻類，屬于綠藻門、綠藻綱、綠球藻目、卵囊藻科、小球藻屬，它生態(tài)分布極廣，在淡水、海水中均有發(fā)現(xiàn)[1].在我國以普通小球藻(Chlorellavulgaris)、橢圓小球藻(Chlorellaellipoidea) 和蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)較為常見，2012 年我國衛(wèi)生部將蛋白核小球藻列為新資源食品[2].

蛋白核小球藻的蛋白含量高達(dá)50%以上，富含人體所需的多種氨基酸，是一種優(yōu)良的單細(xì)胞蛋白源[3].但是，小球藻具有堅韌的細(xì)胞壁，直接食用會影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)效價，對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物學(xué)或加工學(xué)特性的開發(fā)利用也有影響.目前,有文獻(xiàn)報道采用熱堿法[4]、酶解法[5-6]、超聲波破碎法[6-7]、高壓均質(zhì)法[6,8]、反復(fù)凍融法[9]等對小球藻細(xì)胞進(jìn)行破壁處理，然后利用乙醇沉淀法、等電點法或鹽析法分離提取小球藻蛋白[10].胡守珍等[4]使用熱堿法提取小球藻中的蛋白質(zhì)，蛋白提取率達(dá)55.24%，但NaOH添加量高達(dá)20%，有可能造成蛋白質(zhì)水解.王爽等[11]將小球藻溶脹處理后，采用3.9%NaOH溶液作溶劑提取蛋白質(zhì)，提取率僅為5.13%.Zhang等[6]利用乙醇浸泡、纖維素酶解、超聲、均質(zhì)聯(lián)合技術(shù)，分步提取小球藻中的蛋白質(zhì)，蛋白提取率為72.4%，但試驗中提取工藝條件強(qiáng)度較大，蛋白質(zhì)變性程度高.Ursu[8]等采用高壓均質(zhì)和pH為12下提取小球藻中的蛋白質(zhì)，蛋白提取率高達(dá)98%，但其對設(shè)備要求較高.

為了提高蛋白質(zhì)提取率，同時避免蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性或降解，較好保持小球藻蛋白原有的理化特性和營養(yǎng)價值，探索簡便易行的提取方法，本試驗采用超聲波輔助pH調(diào)節(jié)法提取小球藻蛋白，以蛋白溶出率為指標(biāo)，考察液料比、pH、浸提時間及浸提溫度對溶出率的影響，利用單因素和正交試驗優(yōu)化提取工藝條件，并對優(yōu)化條件下提取的小球藻蛋白的主要營養(yǎng)成分、分子量分布和氨基酸組成進(jìn)行分析評價，研究結(jié)果為小球藻蛋白在營養(yǎng)保健食品產(chǎn)業(yè)中的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋白核小球藻粉，由福清市新大澤螺旋藻有限公司提供；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，4×蛋白上樣緩沖液(含DTT)，SolarFast SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色液，購于Solarbio試劑公司；預(yù)染蛋白Marker 10～250 ku，購于上海雅酶生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

JY98-IIIDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；HH-501超級恒溫水浴鍋，金壇市白塔新寶儀器廠；FE20-Five Easy PlusTMpH計，梅特勒托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；TDL-40BXIAN臺式高速冷凍離心機(jī)，上?？低た茖W(xué)儀器廠；FD-1A-80真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；AR224CN萬分之一天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；UV-1800 紫外可見光分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；K9840自動凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；SXT-06索氏提取器，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；Power PacTMBasic電泳儀，美國BIO-RAD公司；Chemi DocTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司；Agilent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫科技.

1.3 試驗方法

1.3.1 超聲波預(yù)處理 將蛋白核小球藻粉按一定液料比與超純水混合，室溫浸泡12 h，隨后在冰浴條件下超聲15 min(超聲2 s、停2 s)，超聲功率600 W，備用.

1.3.2 小球藻蛋白提取工藝 蛋白核小球藻粉→按一定液料比加入超純水→超聲波預(yù)處理→調(diào)節(jié)pH至堿性浸提→冷卻→離心取上清液→調(diào)節(jié)上清液pH至等電點分離蛋白→室溫靜置12 h→離心取沉淀→用超純水洗滌沉淀2～3次→調(diào)節(jié)pH至中性→冷凍干燥→小球藻蛋白粉.

1.3.3 堿性浸提單因素試驗 (1)液料比對蛋白溶出率的影響.固定浸提溫度為50 ℃，浸提時間為120 min，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至12.0，液料比分別為15∶1、30∶1、50∶1、70∶1、90∶1的條件下提取小球藻蛋白.

(2)pH對蛋白溶出率的影響.固定浸提溫度為50 ℃，浸提時間為120 min，液料比為50∶1，用1 mol/L NaOH溶液分別調(diào)節(jié)pH至8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的條件下提取小球藻蛋白.

(3)浸提溫度對蛋白溶出率的影響.固定浸提時間為120 min，液料比為50∶1，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至12.0，浸提溫度分別為30、40、50、60、70 ℃的條件下提取小球藻蛋白.

(4)浸提時間對蛋白溶出率的影響.固定浸提溫度為70 ℃，液料比為50∶1，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至12.0，浸提時間分別為30、60、90、120、150、180 min的條件下提取小球藻蛋白.

1.3.4 堿性浸提正交試驗設(shè)計 為進(jìn)一步優(yōu)化pH調(diào)節(jié)法提取小球藻蛋白的工藝條件，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，固定液料比為50∶1，選取pH、浸提溫度和浸提時間3個因素作為試驗因素，以蛋白溶出率為指標(biāo)設(shè)計試驗，采用L9(34)正交表，正交試驗因素水平見表1.

1.3.5 小球藻蛋白等電點的確定 取離心后的浸提液，等體積分成7份，每份約25 mL，用1 mol/L HCl溶液分別調(diào)節(jié)pH至2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，靜置2 h后于8 000 r/min離心15 min，取上清液，采用GB 5009.5-2016中凱氏定氮法[12]測定上清液中的蛋白質(zhì)含量(mg).上清液的蛋白質(zhì)含量越少，說明沉淀物的蛋白質(zhì)含量越多，以蛋白沉淀率(%)最大時的pH作為小球藻蛋白的等電點.

表1 正交試驗因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

1.4 測定方法

1.4.1 蛋白溶出率 蛋白溶出率(R)的計算公式如式(1)所示：

(1)

其中：R為小球藻蛋白溶出率，%；C為浸提液中的蛋白質(zhì)含量，mg/100 mL；V為浸提液體積，mL；M為蛋白核小球藻粉的質(zhì)量，g;X為蛋白核小球藻粉的的蛋白質(zhì)含量，g/100 g.

1.4.2 蛋白沉淀率 蛋白沉淀率(S)的計算公式如式(2)所示：

(2)

其中：S為蛋白沉淀率，%；C為浸提液中的蛋白質(zhì)含量，mg/100 mL；V為浸提液體積，mL；N為酸沉后上清液中的蛋白質(zhì)含量，mg/100mL;V1為酸沉后上清液體積，mL.

1.4.3 小球藻蛋白粉的主要營養(yǎng)成分測定 采用GB 5009.5-2016中凱氏定氮法[12]測定蛋白質(zhì)含量，采用GB 5009.6-2016中索氏抽提法[13]測定脂肪含量，參照GB/T 15672-2009[14]測定可溶性糖含量，采用GB 5009.3-2016中直接干燥法[15]測定水分含量，采用GB 5009.4-2016[16]測定總灰分含量.

1.4.4 小球藻蛋白粉的分子量分布測定 采用SDS-PAGE測定小球藻蛋白分子量分布.試劑配置及操作過程參照Zheng[17]方法進(jìn)行.濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%，采用R-250考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色檢測，采用Gel-Pro Analyzer分析軟件計算分子量分布.

1.4.5 小球藻蛋白粉的氨基酸組成測定及分析評價 氨基酸組成及含量測定委托江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室.樣品處理采用6 mol/L HCl酸水解，檢驗方法參照GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》[18].

根據(jù)FAO/WHO 1973年建議的氨基酸評分標(biāo)準(zhǔn)模式計算每種必需氨基酸的比值，見式(3).再以最小比值數(shù)×100，即為小球藻蛋白粉的氨基酸評分[19].

(3)

1.4.6 數(shù)據(jù)分析 實驗數(shù)據(jù)均以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)來表示，采用DPSv 18.10高級版軟件進(jìn)行方差分析、(ANOVA)顯著性(P<0.05)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性浸提單因素試驗

2.1.1 液料比對小球藻蛋白溶出率的影響 液料比對小球藻蛋白溶出率的影響見圖1.由圖中可知，在液料比15∶1至50∶1的過程中，蛋白溶出率隨著液料比的增大而迅速上升，此后趨于平緩.這是由于添加一定比例的溶劑后，蛋白質(zhì)的溶解度逐漸增大，而當(dāng)液料比達(dá)到50∶1時，蛋白溶出量已經(jīng)接近最大值，不會再隨液料比的增大而發(fā)生明顯變化.經(jīng)Duncan法多重比較分析顯示，液料比50∶1與15∶1和30∶1時蛋白溶出率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而與更高液料比70∶1和90∶1的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).考慮到液料比太高不利于后續(xù)的濃縮干燥，所以選擇液料比為50∶1為最佳條件.

圖1 液料比對蛋白溶出率的影響 圖2 pH對小球藻蛋白溶出率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on protein extraction efficiency Fig.2 Effect of pH on protein extraction efficiency

2.1.2 pH對小球藻蛋白溶出率的影響 pH對小球藻蛋白溶出率的影響見圖2.由圖中可知，在浸提液pH為8～12時，蛋白溶出率隨著pH的增加而上升；當(dāng)pH到達(dá)12時，蛋白溶出率達(dá)到最大.這是由于pH越高，遠(yuǎn)離蛋白質(zhì)等電點，蛋白質(zhì)分子之間排斥力越大，同時堿性溶液會破壞蛋白質(zhì)分子間氫鍵等次級鍵，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解，使溶解度增大[4].經(jīng)Duncan法多重比較分析顯示，pH為12與pH為8～11時蛋白溶出率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).為了避免蛋白發(fā)生不可逆變性或降解，不宜加堿過多，所以本試驗不考慮更高的pH，選擇pH=12為最佳條件.

2.1.3 浸提溫度對小球藻蛋白溶出率的影響 浸提溫度對小球藻蛋白溶出率的影響見圖3.由圖中可知，在浸提溫度從30 ℃升至70 ℃的過程中，蛋白溶出率隨著溫度的升高而增大，到達(dá)70 ℃時蛋白溶出率最大.這是由于溫度上升，蛋白質(zhì)的溶解度也變大.經(jīng)Duncan法多重比較分析顯示，浸提溫度70 ℃與30～60 ℃時蛋白溶出率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).為了避免溫度過高導(dǎo)致蛋白不可逆變性或降解，所以本試驗不考慮更高的溫度，選擇70 ℃為最佳條件.

2.1.4 浸提時間對小球藻蛋白溶出率的影響 浸提時間對小球藻蛋白溶出率的影響見圖4.由圖中可知，在浸提時間從30 min升至150 min的過程中，蛋白溶出率隨著時間的延長而增大，到達(dá)150 min時蛋白溶出率達(dá)到最大值，而后開始下降.這可能是由于浸提時間過長，部分蛋白質(zhì)變性程度加大，引起溶解度下降，從而降低了蛋白溶出率.經(jīng)Duncan法多重比較分析顯示，浸提時間150 min與前面30～120 min時蛋白溶出率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).因此，選擇150 min為最佳條件.

圖3 浸提溫度對小球藻蛋白溶出率的影響 圖4 浸提時間對小球藻蛋白溶出率的影響Fig.3 Effect of temperature on protein extraction efficiency Fig.4 Effect of distilling time on protein extraction efficiency

2.2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

綜合單因素試驗結(jié)果，采用更高的液料比對蛋白溶出率的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，因此固定液料比為50∶1，選取pH、浸提溫度和浸提時間3個因素作為試驗因素，以蛋白溶出率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗，正交試驗結(jié)果與極差分析如表2所示.由表中極差分析可得，優(yōu)化后的小球藻蛋白提取工藝條件為A3B3C2，即pH 12、浸提溫度70 ℃、浸提時間120 min.由表3方差分析可見，在試驗水平范圍內(nèi)，pH對小球藻蛋白溶出率的影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而浸提溫度和浸提時間對小球藻蛋白溶出率的影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；三個影響因素的主效應(yīng)關(guān)系為pH > 浸提溫度 > 浸提時間.通過驗證實驗，測得優(yōu)化提取工藝條件下小球藻蛋白溶出率為(34.93±0.94)%.

2.3 小球藻蛋白等電點的確定

小球藻蛋白等電點的測定見圖5.由圖中可知，當(dāng)pH為3.5時蛋白沉淀率最高，達(dá)(55.47±1.25)%，小球藻蛋白得到最大程度的聚集.因此，確定該小球藻蛋白的等電點為pH=3.5，在此條件下分離小球藻浸提液中的蛋白沉淀物，冷凍干燥后即為小球藻蛋白粉.這與Ursu等[8]采用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)小球藻蛋白提取液至pH=4，獲得蛋白沉淀相接近.

表2 正交試驗結(jié)果與極差分析

圖5 小球藻蛋白等電點的測定Fig.5 Determination of isoelectric point of chlorella protein

表3 方差分析表

2.4 小球藻蛋白粉的基本組成分析

圖6 小球藻蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.6 SDS-PAGE of Chlorella protein 注：泳道1為2 mg/mL小球藻蛋白，泳道2 為4 mg/mL小球藻蛋白，M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白.

2.4.1 小球藻蛋白粉的主要營養(yǎng)成分測定 經(jīng)測定(以干基計)，小球藻蛋白粉中蛋白質(zhì)含量達(dá)(66.4±1.6)%，脂肪含量為(8.9±1.1)%，可溶性糖含量為(8.5±1.2)%，灰分含量為(12.7±0.7)%，水分含量為(9.8±0.8)%.測定結(jié)果顯示，小球藻蛋白粉中脂肪含量仍保留較多，這可能是由于小球藻中含具有兩性特征的磷脂，與水和蛋白質(zhì)產(chǎn)生相互作用，蛋白質(zhì)在接近等電點的沉淀過程中發(fā)生重折疊，脂質(zhì)被包埋在重折疊蛋白內(nèi)部而引起的[20].另外，這些小球藻蛋白多數(shù)為色素蛋白，其中含有的葉綠素具有親脂基團(tuán)，一定程度上也結(jié)合了部分脂質(zhì).

2.4.2 小球藻蛋白的分子量分布 通過SDS-PAGE分析小球藻蛋白的分子量分布，其條帶顏色越深，代表蛋白含量越大.由小球藻蛋白SDS-PAGE電泳圖譜(圖6)可見，小球藻蛋白有兩條明顯的條帶，主要集中在13.1 ku和30.6 ku，這兩個亞基的占比分別為67.8%和32.2%.

2.4.3 小球藻蛋白的氨基酸組成分析 蛋白質(zhì)中所含必需氨基酸的種類、數(shù)量和構(gòu)成比例決定了其營養(yǎng)價值.小球藻蛋白粉的氨基酸組成及含量見表4.

表4 小球藻蛋白粉的氨基酸組成及含量

由表4可知，小球藻蛋白粉中含有17種氨基酸，其中谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和丙氨酸的含量較高，組氨酸、甲硫氨酸的含量較低，半胱氨酸的含量最低，僅為0.6 mg/g.小球藻蛋白粉中必需氨基酸含量占氨基酸總量(EAA/TAA)為40.14%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值(EAA/NEAA)為72.85%，均高于世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)提出的蛋白質(zhì)參考模式(EAA/TAA應(yīng)達(dá)到40%，EAA/NEAA應(yīng)大于60%)[3,21].

通過計算小球藻蛋白粉中必需氨基酸占蛋白質(zhì)的含量，與FAO/WHO的建議蛋白模式進(jìn)行比較，得到氨基酸比值.小球藻蛋白粉的必需氨基酸組成見表5.由表中可見，甲硫氨酸+半胱氨酸的比值最小，僅為0.40，為第一限制性氨基酸；其他必需氨基酸的比值均在0.87～1.20，接近標(biāo)準(zhǔn)參考模式[19]，說明制備的小球藻蛋白粉是一種潛在的優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源.

表5 小球藻蛋白粉的必需氨基酸組成

3 結(jié)論

超聲波輔助pH調(diào)節(jié)法可有效提取小球藻蛋白，蛋白溶出率為34.9%，提取物中粗蛋白含量為(66.4±1.6)%，必需氨基酸含量豐富，占比氨基酸總量(EAA/TAA)40.14%，除含硫氨基酸外，其他必需氨基酸含量均接近或高于FAO/WHO推薦值，研究結(jié)果為小球藻蛋白在營養(yǎng)保健食品產(chǎn)業(yè)中的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)數(shù)據(jù).小球藻蛋白是一種潛在的優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源，可進(jìn)一步研究其加工性能和生物活性功能，為加工利用小球藻資源開發(fā)藻類高附加值產(chǎn)品提供新途徑.