李莉，朱丹丹，張鳳

1.瀘州市婦幼保健院兒科，四川 瀘州 646000；2.綿陽市第三人民醫(yī)院(四川省精神衛(wèi)生中心)，四川 綿陽 621000

2-甲基丁酰-輔酶A脫氫酶缺乏癥(2-methylbutyryl-CoA dehydrogenase deficiency，2-MBAD)是 由ACADSB基因變異引起的異亮氨酸分解代謝受損的隱性遺傳代謝性疾病，也稱短/支鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥(short/branched chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency，SBCADD)[1]。在新生兒疾病篩查開展前，多由出生后出現(xiàn)喂養(yǎng)困難、低血糖或在兒童期出現(xiàn)發(fā)育遲緩、智力障礙、癲癇、肌肉萎縮、肌張力減退、自閉癥等臨床表現(xiàn)進(jìn)行檢查而確診，但隨著串聯(lián)質(zhì)譜的開展，大部分患者在出現(xiàn)臨床表現(xiàn)前已被確診[2]。本研究對3例串聯(lián)質(zhì)譜篩查時發(fā)現(xiàn)異戊酰基肉堿(C5)升高患者進(jìn)行基因檢測，確診為2-MBAD，并進(jìn)行ACADSB基因變異分析，以明確其致病原因，為家系的遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018—2020年瀘州市婦幼保健院新生兒疾病篩查串聯(lián)質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)異戊?；鈮A(C5)升高疑似2-MBAD的3例患者，收集串聯(lián)結(jié)果及臨床資料，并對其進(jìn)行遺傳代謝性疾病相關(guān)基因檢測。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 經(jīng)監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書、并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)后，抽取患者及其父母靜脈血2 mL，EDTA抗凝，送北京博奧醫(yī)學(xué)檢驗所，使用天根生化科技(北京)有限公司的微量樣品基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2.2 高通量測序及Sanger測序驗證 采用探針法靶向捕獲3 877個已知的疾病基因，配合Illumina Next 500測序平臺獲得測序數(shù)據(jù)，篩選出變異位點。再用Sanger測序方法驗證患者父母。

1.2.3 變異位點的生物信息學(xué)分析 用SIFT、PolyPhen-2、MutationTaster等軟件對候選點變異進(jìn)行位點保守性預(yù)測、蛋白功能預(yù)測；用GnomAD、ExAC和1000Genomes數(shù)據(jù)庫對變異位點進(jìn)行人群頻率注釋；用ClinVar數(shù)據(jù)庫對變異位點的致病性判讀結(jié)果進(jìn)行注釋。選擇GnomAD等數(shù)據(jù)庫中東亞人群頻率低于0.01，并且位點保守性強、對蛋白結(jié)構(gòu)或功能影響劇烈，ClinVar中為非良性變異，且基因?qū)?yīng)的臨床表型與患者表型吻合的基因變異位點查閱文獻(xiàn)進(jìn)行變異位點的致病性分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

2.1.1 病例1 男，58 d，因新生兒疾病篩查C5升高就診，患者系G2P1，足月順產(chǎn)，出生體質(zhì)量3.3 kg，無窒息、搶救病史，患者生后精神奶量可，大小便正常。父母體健，非近親結(jié)婚，否認(rèn)家族遺傳病史。查體：體質(zhì)量4.1 kg，身長53 cm，頭圍39 cm。前囟1.8 cm×1.4 cm，平軟，神清，皮膚彈性可，心肺腹無異常；四肢肌力、肌張力正常，神經(jīng)系統(tǒng)檢查無異常。輔助檢查：血常規(guī)、肝腎功能、心肌酶譜、電解質(zhì)、血糖、血氨、血乳酸未見異常。串聯(lián)結(jié)果：C5 0.56μmol/L，C5/C2 0.04，C5/C3 0.40(第一次)；C5 0.60μmol/L，C5/C2 0.04，C5/C3 0.30(第二次)(參考范圍C5 0～0.4μmol/L，C5/C2 0～0.04，C5/C3 0～0.4)。

2.1.2 病例2 女，21 d，因新生兒疾病篩查C5升高就診，患者系G1P1，足月順產(chǎn)，出生體質(zhì)量2.8 kg，無窒息、搶救病史，患者生后精神奶量可，大小便正常。父母體健，非近親結(jié)婚，否認(rèn)家族遺傳病史。查體：體質(zhì)量3.2 kg，身長51 cm，頭圍36 cm。前囟1.8 cm×1.5 cm，平軟，神清，皮膚彈性可；心肺腹無異常；四肢肌力、肌張力正常，神經(jīng)系統(tǒng)檢查無異常。輔助檢查：血常規(guī)、肝腎功能、心肌酶譜、電解質(zhì)、血糖、血氨、血乳酸未見異常。串聯(lián)結(jié)果：C5 7.94μmol/L，C5/C2 0.19，C5/C3 1.82(第一次)；C5 8.81μmol/L，C5/C2 0.91，C5/C3 5.99(第二次)。

2.1.3 病例3 女，44 d，因新生兒疾病篩查C5升高就診，患者系G1P1，足月順產(chǎn)，出生體質(zhì)量3.1 kg，無窒息、搶救病史，患者生后精神奶量可，大小便正常。父母體健，非近親結(jié)婚，否認(rèn)家族遺傳病史。查體：體質(zhì)量4.0 kg，身長51.6 cm，頭圍38 cm。前囟1.8 cm×1.4 cm，平軟，神清，皮膚彈性可；心肺腹無異常；四肢肌力、肌張力正常，神經(jīng)系統(tǒng)檢查無異常。輔助檢查：血常規(guī)、肝腎功能、心肌酶譜、電解質(zhì)、血糖、血氨、血乳酸未見異常。串聯(lián)結(jié)果：C5 1.37μmol/L，C5/C2 0.14，C5/C3 0.93(第一次)；C5 1.54μmol/L，C5/C2 0.04，C5/C3 0.35(第二次)。

2.2 基因檢測結(jié)果 病例1，ACADSB基因外顯子5,c.655G＞A(p.V219M)(純合變異)，分別來自父母；病例2，ACADSB基因外顯子10，c.1165 A＞G(p.M389V)(純合變異)，分別來自父母；病例3，ACADSB基因外顯子5,c.655G＞A(p.V219M)(雜合變異)，來自母親，外顯子10,c.1165 A＞G(p.M389V)(雜合變異)，來自父親，如圖1。通過Phyre2功能軟件可知655位纈氨酸及1165位蛋氨酸位于相對保守區(qū)域，如圖2。c.655G＞A(p.V219M)及c.1165A＞G(p.M389V)位點突變沒有導(dǎo)致氨基酸之間的氫鍵改變，如圖3。

圖1 ACADSB基因變異測序圖(箭頭所指為變異位點)

圖2 ACADSB基因變異圖

圖3 變異位點氫鍵連接

3 討論

異亮氨酸作為支鏈氨基酸(branched-chain amino acids，BCAAs)之一，在生長、免疫、蛋白質(zhì)代謝、脂肪酸代謝、葡萄糖轉(zhuǎn)運等全身生理功能中起著至關(guān)重要的作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，異亮氨酸可以誘導(dǎo)宿主防御肽(β-防御素)的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)宿主的先天免疫和適應(yīng)性免疫，進(jìn)而改善免疫系統(tǒng)，包括免疫器官、細(xì)胞和活性物質(zhì)。此外，異亮氨酸可通過增加抗菌素的表達(dá)，恢復(fù)某些病原體對人和動物健康的影響[4]。異亮氨酸代謝異?？芍露喾N代謝性疾病[5]，2-MBAD就是其中之一，如圖4所示。2-MBAD是由ACADSB基因變異所致，發(fā)病率極低，目前全球發(fā)病率不詳，但在東南亞苗族和苗族后裔中較為常見，該區(qū)域發(fā)病率高達(dá)1/250～1/500，有文獻(xiàn)報道，我國泉州市發(fā)病率為1/30 379[1]。ACADSB基因(NG_008003.1)位于10號染色體(10q26.13)，共11個外顯子，編碼432個氨基酸的2-甲基丁酰輔酶A脫氫酶，該酶在異亮氨酸(Isoleucine)代謝途徑中發(fā)揮重要作用，該基因缺陷導(dǎo)致2-甲基丁酰肉堿、2-甲基丁酰甘氨酸等代謝物異常蓄積[6]。

圖4 異亮氨酸代謝

研究發(fā)現(xiàn)，苗族華人大部分2-MBAD病例無臨床癥狀，可能與其他短支鏈酰基輔酶A活性重疊，避免異亮氨酸有害代謝物的積累[7]，但在感染和應(yīng)激情況下可能發(fā)生新生兒危象，嚴(yán)重者發(fā)生發(fā)育遲緩、智力障礙、癲癇、肌肉萎縮、肌張力減退、自閉癥等[8]。

ACADSB基因c.655G＞A(p.V219M)的變異不屬于多態(tài)性變化，發(fā)生頻率極低，目前尚無報道。該位點變異219位纈氨酸與235位苯丙氨酸之間的氫鍵沒有發(fā)生改變，但與220位的蛋氨酸形成二肽改變。有研究發(fā)現(xiàn)，纈氨酸-蛋氨酸經(jīng)歷電子吸收，產(chǎn)生帶有SO鍵的陽離子，該陽離子可以在纈氨酸-蛋氨酸中性子上去質(zhì)子化，產(chǎn)生的中性自由基。但蛋氨酸-蛋氨酸二肽不能產(chǎn)生中性自由基，因此導(dǎo)致2-甲基丁酰輔酶A脫氫酶活性減低[9]。

c.1165A＞G(p.M389V)為熱點變異位點，位于親水口袋中[10]，在美國威斯康星州該位點純合變異占所有變異位點中的1.3%，雜合子變異占21.8%[11]；而在中國泉州該位點變異率占所有變異位點中的33.3%[1]。該位點由蛋氨酸變異為纈氨酸，氨基酸之間的氫鍵沒有改變，但分子遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該位點使ACADSB基因在轉(zhuǎn)錄過程中外顯子10跳躍，導(dǎo)致2-甲基丁酰輔酶A脫氫酶活性減低[7]。

2-MBAD的治療資料少且無統(tǒng)一的治療共識，目前治療措施以改善臨床癥狀、低蛋白飲食及補充肉堿為主，避免禁食。

綜上所述，本文3例患者在新生兒疾病篩查時發(fā)現(xiàn)串聯(lián)質(zhì)譜異常，基因檢測診斷2-MBAD，予以低蛋白飲食及補充肉堿，目前尚未發(fā)生發(fā)育遲緩、智力障礙、癲癇、肌肉萎縮、肌張力減退等，但后期是否發(fā)生，需長時間追蹤隨訪。c.655G＞A(p.V219M)目前暫無報道，新變異的檢出豐富了基因變異譜，為家系的遺傳咨詢提供了依據(jù)。