陸子贇 岳朝艷 應(yīng)春妹

【摘要】目的：通過對復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（RSA）患者抗核抗體（ANA）檢測結(jié)果的分析，探討 ANA 檢測與 RSA 的相關(guān)性。方法：采用間接免疫熒光法（IIF）測定2020年7～12月收集的1432例 RSA 患者（觀察組）與同時期無不良孕產(chǎn)史的134例正常孕婦（對照組）的 ANA，采用免疫印跡法（LIA）測定其 ANA 譜。比較兩個組別檢測結(jié)果，并分析其與 RSA 關(guān)系。結(jié)果：觀察組中檢出 ANA陽性292例（20.39%）。對照組檢出 ANA陽性9例（6.72%）。觀察組常見 ANA 核型為顆粒型（36.32%）和致密型（32.89%）。觀察組 ANA 譜檢測，各類抗體均有檢出，其中抗 Ro-52抗體（24.55%）和抗 SS-A 抗體（24.19%）檢出率最高， ANA 陰性者也有 ANA 譜檢出。ANA 與 ANA 譜聯(lián)合檢測，兩種方法聯(lián)合檢測陽性率達(dá)到27.65%，兩種方法聯(lián)合檢測總體符合率達(dá)到.79.40%，觀察組 ANA 和 ANA 譜聯(lián)合檢測的靈敏度為 98.49%，特異度為99.61%;觀察組聯(lián)合檢測陽性率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=20.47， P<0.01）。結(jié)論： ANA及 ANA譜聯(lián)合檢測有助于 RSA 的臨床診斷。

【關(guān)鍵詞】復(fù)發(fā)性流產(chǎn);抗核抗體;抗核抗體譜

【中圖分類號】R446【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2096-5249（2022）06-0135-05

Analysis of application of antinuclear antibody detection and an- tinuclear antibody spectrum detection in diagnosis of recurrent abortion

Lu Zi-yun， Yue Chao-yan， Ying Chun-mei△

Department of Laboratory Medicine， Obstetrics and Gynecology Hospital Affiliated to Fudan University， Shanghai 200011， China

【Abstract】Objective：To investigate the correlation between ANTinuclear antibody（ANA）and RSA in pa- tients with recurrent abortion（RSA）. Methods：Indirect immunofluorescence assay（IIF）was used to measure ANA in 1432 RSA patients（observation group）collected from July to December 2020 and 134 normal pregnant women（control group）without adverse pregnancy history during the same period. The results of the two groups were compared，and the relationship between RSA and the two groups was analyzed. Results：In the observa- tion group，292 cases（20.39%） were ANA positive. In the control group，9 cases（6.72%） were ANA positive. The common ANA karyotypes in the observation group were granular（36.32%）and dense（32.89%）. ANA spectrum detection showed that all kinds ofantibodies were detected in the observation group，among which anti-Ro-52 an- tibody（24.55%）and anti-SS-A antibody（24.19%）had the highest detection rates. ANA spectrum detection was also found in ANA negative patients. ANA and ANA spectrum combined detection，the positive rate of the com- bined detection of the two methods reached 27.65%，the overall coincidence rate of the combined detection of thetwo methods reached 79.40%，the sensitivity and speci?city ofthe combined detection of antinuclear antibody and antinuclear antibody spectrum of the observation group was 98.49%，99.61%. The positive rate of combined de- tection in observation group was signi?cantly higher than that in control group，and the di?erence was statistically signi?cant（χ2=20.47，P<0.01）. Conclusion：The combined detection of ANA and ANA spectrum is helpful forthe clinical diagnosis ofRSA.

【Key words】Recurrent spontaneous abortion;Antinuclear antibodies;Antinuclear antibody spectrum

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）也稱為習(xí)慣性流產(chǎn)，其定義為連續(xù)發(fā)生3次或3次以上的自然流產(chǎn)，通常發(fā)生的時間在妊娠20周前[1]。引起 RSA 的病因既復(fù)雜多又樣，而且可能同時有多種因素異常而致其發(fā)病，其中能夠被識別的病因包括染色體異常、生殖道異常、內(nèi)分泌和免疫功能異常等約占全部病因的50%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，夫妻染色體異常包括平衡易位、羅伯遜易位等可以影響 RSA 的染色體核型和基因多態(tài)性，從而表現(xiàn)為胚胎發(fā)育的基因出現(xiàn)病理性異常，影響免疫、內(nèi)分泌等多種胚胎發(fā)育障礙，甚至引起胚胎死亡[2]。引起 RSA 的原因之一是免疫反應(yīng)，而抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）則是免疫反應(yīng)的常見指標(biāo)，很多研究表明 ANA 與 RSA 有相關(guān)性。本研究旨在通過分析本院2020年7～12月1566例 RSA 患者和正常妊娠孕婦血清中的 ANA 及 ANA譜檢測，分析導(dǎo)致 RSA 的相關(guān)指標(biāo)，為臨床 RSA 患者的診斷和治療提供實驗室依據(jù)。

1 對象與方法

1.1研究對象

選取在本院2020年7～12月收集的1432例 RSA 患者作為觀察組，選取同時期就診于本院的正常妊娠婦女共134例作為對照組。觀察組年齡22～47（34.4±4.3）歲，對照組年齡21～41（32.6±3.8）歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)： RSA 診斷符合世界衛(wèi)生組織的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：妊娠在20周以前終止，胎兒體重在500 g以下;均為自然受孕。

排除標(biāo)準(zhǔn)：合并有生殖器感染、畸形等相關(guān)病變;有自然流產(chǎn)史、死胎和死產(chǎn)史;精神異常不能配合研究。

1.2方法

1.2.1試劑

ANA 檢測由德國歐蒙公司EUROBlotMasterⅡ全自動免疫印跡儀及相應(yīng)配套試劑進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2.2試驗方法

抽取靜脈血2 mL，靜置30 min后離心（3000r/ min，10 min）。血清操作過程嚴(yán)格按照儀器使用說明書進(jìn)行并進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.3原理

檢測 ANA 采用猴肝片及HEP-2細(xì)胞作為抗原基質(zhì)，應(yīng)用間接免疫熒光法（IIF）檢測位置抗原和抗體。

采用免疫印跡法（LIA）檢測 ANA譜，將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合，首先進(jìn)行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后進(jìn)行電轉(zhuǎn)移和酶免疫定位，綜合SDS-PAGE 的高分辨力和 ELISA法的高特異性和敏感性，根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測樣品中的某種蛋白。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用 SPSS 24.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。計數(shù)資料用[ n（%）]表示，應(yīng)用χ2檢驗;計量資料符合正態(tài)性分布，則選擇獨(dú)立性 t 檢驗進(jìn)行分析，以（±s）表示。以 P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ANA檢測結(jié)果對比

本研究中，觀察組共1432例血清樣本，檢出ANA 陽性292例（20.39%）;對照組134例血清樣本，檢出 ANA 陽性9例（6.71%）。觀察組與對照組的 ANA 檢測結(jié)果陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.0001），見表1。

2.2 ANA核型分布對比

通過熒光顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)以及熒光染色模型的特征對 ANA 核型進(jìn)行分類。本研究患者血液樣本中主要分離出顆粒型、胞漿型、致密型和核仁型，其中觀察組顆粒型和致密型最常見，所占比例為36.30%和33.22%，對照組顆粒型和胞漿型更常見，所占比例為33.33%和33.33%。觀察組和對照組 ANA 核型分布比例比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），見表2。

2.3 ANA譜檢測結(jié)果對比

對觀察組1432例血液樣本進(jìn)行 ANA譜檢測結(jié)果得出， ANA譜陽性的有205例（14.32%），相較于對照組134例樣本的 ANA譜檢測陽性的7例（5.22%）明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），見表3。

2.4 ANA與ANA譜聯(lián)合檢測結(jié)果比較

觀察組 ANA 的陽性率為20.39%（292/1432），ANA 譜的陽性率為14.32%（205/1432）。兩種方法聯(lián)合檢測時，396例樣本為陽性，陽性率達(dá)到27.65%，兩種方法聯(lián)合檢測的總體符合率達(dá)到79.40%;對照組中 ANA 檢測陽性率為6.72%（9/134），ANA譜檢測陽性率為5.22%（7/134）。兩種檢測方法聯(lián)合檢測時陽性率為9.70%（13/134），總體符合率達(dá)到92.54%。兩種方法聯(lián)合檢測時，觀察組結(jié)果和對照組檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），見表4。

2.5 ANA譜抗體類型分布對比

ANA譜可檢測15種特異性抗體，包括核糖核蛋白（nRNP）抗體、抗史密斯抗體（Sm）、抗組氨酰轉(zhuǎn)運(yùn) RNA 合成酶（Jo-1）抗體、干燥綜合征相關(guān)抗體SSA 和 SSB、 ROPM-Scl、CENPB、抗增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體、抗雙鏈 DNA（dsDNA）抗體、抗核小體抗體（AnuA）等。

本研究中，觀察組中有205例 ANA譜陽性，各種不同 ANA譜抗體共檢出277例次，百分比居前2位的抗體分別是抗Ro-52抗體和抗SS-A抗體，所占比例分別是24.55%和24.19%，見表5。

本研究中，對照組中有3例 ANA 陽性和 ANA譜同時陽性的樣本，8例樣本 ANA 陰性而 ANA譜呈陽性，共計檢出11例次 ANA譜陽性抗體。觀察組與對照組 ANA譜抗體類型分布無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），見表5。

2.6抗核抗體和抗核抗體譜聯(lián)合檢測的準(zhǔn)確性

將觀察組1432例 RSA 患者的血清樣本進(jìn)行Wsetern-Blot 檢測抗核抗體，將結(jié)果與ANA 和 ANA 譜聯(lián)合檢測方法進(jìn)行比較， ANA 和 ANA譜聯(lián)合檢測的靈敏度為98.49%，特異度為99.61%，見表6。

3 討論

當(dāng)今社會女性生育問題得到了一定重視，不過由于過快的生活節(jié)奏、人工流產(chǎn)手術(shù)、輔助生殖技術(shù)增加等各種原因的出現(xiàn)，生育期婦女復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的比例也在提高，引起了人們的注意。引發(fā) RSA 的病因其實十分復(fù)雜，結(jié)合目前國內(nèi)外相關(guān)研究，可能同時有多種因素異常而致其發(fā)病，其中能夠被識別的病因包括染色體異常、生殖道異常、母體內(nèi)分泌和免疫功能異常等約占全部病因的50%，其中染色體畸形異常是主要病因，早期 RSA 大多數(shù)均由胚胎的染色體畸變導(dǎo)致[3]。進(jìn)一步流行病學(xué)相關(guān)研究表明，黃體功能不全可能伴發(fā)于23%～60%的 RSA患者，分析可能與黃體功能不全導(dǎo)致黃體酮水平過低，子宮內(nèi)膜剝脫和轉(zhuǎn)換障礙，導(dǎo)致RSA。追根溯源，如果患者體內(nèi)雄激素增高、催乳素增高等能夠引起黃體功能障礙的危險因素也能導(dǎo)致流產(chǎn)和RSA的發(fā)生[4]。以上引發(fā)RSA因素中，免疫因素相關(guān)調(diào)查研究結(jié)果在近年逐漸被引起重視。母體受孕過程中的胚胎著床過程本質(zhì)從免疫學(xué)角度來說是一種同種異體移植過程，這個過程中母體的免疫系統(tǒng)對于胚胎抗原不會識別為一體抗原，也不會產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)，即母-胎免疫耐受自身免疫病所致[5]。自身免疫相關(guān)抗體檢測中發(fā)現(xiàn)存在ANA 陽性者發(fā)生 RSA 的風(fēng)險較正常人明顯升高但機(jī)制尚未完全闡明。

本研究通過相關(guān)免疫檢測，顯示觀察組的 ANA 和 ANA譜檢測結(jié)果陽性率均高于對照組，證明這兩項檢測結(jié)果對于預(yù)測 RSA 的發(fā)生有顯著的價值，與以往相關(guān)文獻(xiàn)報道結(jié)果一致。文獻(xiàn)指出， RSA 主要由自身抗體異常導(dǎo)致，目前相關(guān)研究標(biāo)表明主要相關(guān)抗體有 ANA、抗磷脂抗體、抗甲狀腺抗體等，這些抗體的檢測也能為 RSA 的確診和相關(guān)病因的篩查提供重要依據(jù)，尤其是上述抗體的聯(lián)合檢測更進(jìn)一步提高診斷的靈敏度和特異性[6]。Veglia等[7]發(fā)現(xiàn) RSA 患者的 ANA+血清注射進(jìn)小鼠腹部體外研究發(fā)現(xiàn)小鼠妊娠丟失率顯著增加，并且發(fā)現(xiàn)小鼠胎盤中補(bǔ)體C3沉積增加，分析 RNS 發(fā)生可能與 ANA+所致免疫反應(yīng)補(bǔ)體增加致胎盤損傷有關(guān)。 Girardi 等[8]在 APS 小鼠模型上也證實了 ANA 通過介導(dǎo)補(bǔ)體因子的激活導(dǎo)致妊娠丟失事件發(fā)生。進(jìn)一步探究其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，妊娠女性對胚胎半抗原有天然的免疫耐受，而 ANA 相關(guān)的免疫復(fù)合物則會被母體免疫系統(tǒng)識別并釋放炎癥因子，發(fā)生體液免疫應(yīng)答，反之更加加劇了炎癥因子和 ANA 的產(chǎn)生，更促進(jìn)了免疫復(fù)合物沉積和補(bǔ)體的過度激活，造成血管壁破裂，子宮收縮引起流產(chǎn)的發(fā)生[9-10]。 ANA 對體內(nèi)的自身免疫過程反應(yīng)的敏感性很高， ANA 陽性則能明確免疫反應(yīng)發(fā)生在母體內(nèi)并且干預(yù)了胎盤的發(fā)育，免疫反應(yīng)復(fù)合物極易沉著于胎盤血管內(nèi)壁，造成管壁損傷和 RSA 的發(fā)生[11]。此外研究發(fā)現(xiàn)母體凝血異常也與 ANA抗體密切相關(guān)， ANA 陽性影響血流動力學(xué)，導(dǎo)致胎盤血管內(nèi)微血栓形成，嚴(yán)重的可導(dǎo)致胎盤梗死，胎兒發(fā)生缺氧窒息[12]。

此外，本研究采用 ANA 和 ANA譜兩種方法聯(lián)合檢測時，兩種方法的總體符合率都較高分別為79.40%和92.54%。聯(lián)合檢測的靈敏度為98.49%，特異度為99.61%;聯(lián)合檢測時，觀察組陽性率也顯著高于對照組，提示 ANA 和 ANA譜聯(lián)合檢測更有助于提高 RSA的臨床診斷能力。既往研究發(fā)現(xiàn)[13]，ANA 和 ANA譜聯(lián)合檢測時， ANA 的陽性檢出率可高達(dá)96.7%，且減少假陰性，選擇一個敏感度較高的檢測組合顯得得十分必要。 IIF 和 LIA是臨床上最常用的兩種檢測方法，其中IIF優(yōu)勢在于檢測位置抗原和抗體，但是存在假陰性[14]，LIA 的優(yōu)勢在于包被抗原是純化的抗原，不僅能提高檢測敏感性，還能保證測定抗原的準(zhǔn)確性和特異性[15]，但目前許多自身抗體的確切抗原尚不明確，許多抗原不易被純化，故僅有少部分抗原有純化的產(chǎn)品能用于特異性檢測。另外，在本研究中發(fā)現(xiàn)， RSA 患者和普通孕產(chǎn)婦的 ANA 核型分布中以顆粒型和致密型的分布比例較高，但兩者間無顯著差異。本研究未發(fā)現(xiàn) ANA 核型分布與 RSA 發(fā)病機(jī)制的關(guān)系，既往研究亦尚未給出明確結(jié)論，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述， RSA 的發(fā)生與 ANA 和 ANA譜陽性有密切聯(lián)系， ANA、ANA譜檢測陽性率有助于 RSA 臨床診斷;當(dāng)兩種方法聯(lián)合檢測時，陽性率相對更高，為臨床提供更有效診斷依據(jù)，讓患者能得到準(zhǔn)確診斷和及時治療。

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（收稿日期：2021-03-12）