牛曉磊 馮世鵬 蔣凌雁 王倩男 陳銀華

[摘 要] 分子生物學(xué)相關(guān)知識(shí)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)是生物類相關(guān)專業(yè)學(xué)生應(yīng)該掌握的基本知識(shí)及技術(shù)，在學(xué)生今后的學(xué)習(xí)或工作中占據(jù)極其重要的地位。通過探討分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)過程及教學(xué)評(píng)價(jià)方式，以學(xué)生動(dòng)手實(shí)驗(yàn)過程中遇到的問題為導(dǎo)向進(jìn)行改革探索，從而提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)動(dòng)手操作能力及分析和解決實(shí)驗(yàn)中問題能力，并改革實(shí)驗(yàn)課程的評(píng)價(jià)方式，為今后高等院校分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供參考。

[關(guān)鍵詞] 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程;教學(xué)改革;問題導(dǎo)向

[基金項(xiàng)目] 2019年度海南省高等學(xué)校教育教學(xué)改革研究項(xiàng)目“分子生物學(xué)課程教學(xué)內(nèi)容及實(shí)驗(yàn)體系整體優(yōu)化”（Hnjg2019ZD-2）;2019年度海南大學(xué)教育教學(xué)改革研究項(xiàng)目“分子生物學(xué)課程教學(xué)內(nèi)容及實(shí)驗(yàn)體系整體優(yōu)化”（hdjy1926）;2020年度教育部新農(nóng)科研究與改革實(shí)踐項(xiàng)目“熱帶新農(nóng)科多樣化人才培養(yǎng)體系研究與實(shí)踐”（NDE2020-20）（教高廳函〔2020〕20號(hào)）

[作者簡介] 牛曉磊（1979—），男，河南安陽人，博士，海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院副教授，主要從事熱帶作物遺傳育種研究;馮世鵬（1980—），男，湖北孝感人，博士，海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院副教授，主要從事熱帶作物遺傳育種研究;蔣凌雁（1989—），女，湖南長沙人，博士，海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院副教授，主要從事熱帶作物與病原菌互作研究。

[中圖分類號(hào)] G642.0 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-9324（2022）15-0097-04 [收稿日期] 2021-09-27

“分子生物學(xué)”是生物科學(xué)、生物技術(shù)專業(yè)的核心主干課程，在其他生物相關(guān)專業(yè)有類似的課程如“基因克隆”“生物技術(shù)概論”等選修課。因此，分子生物學(xué)相關(guān)理論與技術(shù)是生物類相關(guān)專業(yè)學(xué)生重點(diǎn)學(xué)習(xí)內(nèi)容之一。而分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)既能鍛煉學(xué)生的動(dòng)手能力，又能加深學(xué)生對(duì)理論知識(shí)的掌握程度。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式與教學(xué)方法的改革是目前分子生物學(xué)教學(xué)改革的重點(diǎn)[1]。

海南大學(xué)“分子生物學(xué)”課程選擇的教材是朱玉賢主編的《現(xiàn)代分子生物學(xué)》[2]，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容是根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[3]選編的內(nèi)容。分子生物學(xué)及其實(shí)驗(yàn)的教學(xué)改革在不同地區(qū)均有一些嘗試，在教材選擇、教師配制、翻轉(zhuǎn)課堂、雙語教學(xué)、案例教學(xué)等方面均有應(yīng)用，并取得了一定的成效[4]。目前的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程，多數(shù)的流程仍然是教師講解，包括實(shí)驗(yàn)原理、材料方法、實(shí)驗(yàn)步驟、注意事項(xiàng)等;學(xué)生聽完后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，主要是根據(jù)老師的講解機(jī)械模仿。然而筆者在長期的教學(xué)實(shí)踐過程中發(fā)現(xiàn)，雖然實(shí)驗(yàn)前對(duì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行了詳細(xì)講解，然而大多數(shù)學(xué)生對(duì)相關(guān)分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)原理缺乏了解，實(shí)驗(yàn)操作照葫蘆畫瓢的機(jī)械模仿較多，對(duì)老師的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不理解，實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的現(xiàn)象無法解釋，既不知道實(shí)驗(yàn)為什么成功，也不知道實(shí)驗(yàn)為什么失敗。這就如同小朋友走路，無論告訴他們多少走路方法、注意事項(xiàng)，他自己走路的時(shí)候還是會(huì)摔跤;而他自己在走路的過程中，摸爬滾打，無意識(shí)中總結(jié)經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，終于學(xué)會(huì)了走路。有鑒于此，筆者設(shè)計(jì)了一套以問題為導(dǎo)向的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革方案，發(fā)現(xiàn)效果很好。

一、改革內(nèi)容

改革內(nèi)容主要包括兩方面：一是改革實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程;二是改革學(xué)生成績?cè)u(píng)價(jià)方法。教學(xué)過程的改革措施主要包括如下幾方面。

（一）教學(xué)時(shí)間控制

實(shí)驗(yàn)教學(xué)一般安排在上午或者下午，總時(shí)長約3～4節(jié)課，為了充分利用實(shí)驗(yàn)課堂時(shí)間，要求學(xué)生必須課前預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)過程;課堂上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作及失敗后的重復(fù)實(shí)驗(yàn)操作;實(shí)驗(yàn)中間或?qū)嶒?yàn)過程中遇到問題隨時(shí)與教師進(jìn)行探討;實(shí)驗(yàn)課后進(jìn)行總結(jié)報(bào)告。

（二）制造問題

有兩方面的問題：一是學(xué)生自己制造的問題，二是老師針對(duì)性地提出的問題。先讓學(xué)生根據(jù)本次課程的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容自己設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)整個(gè)流程，然后直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，但由于學(xué)生缺乏知識(shí)及經(jīng)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程中必然出現(xiàn)許多問題。至于老師提出的問題，主要是根據(jù)學(xué)生實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展情況與對(duì)實(shí)驗(yàn)所用到的知識(shí)的理解，針對(duì)性地提出一些問題。

（三）分析原因

學(xué)生實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的問題實(shí)際上激發(fā)了學(xué)生的自主學(xué)習(xí)欲望，學(xué)生在自己的實(shí)驗(yàn)中碰到問題時(shí)，會(huì)迫切地想知道為什么會(huì)產(chǎn)生這樣的結(jié)果，以及怎樣避免或者解決，怎么進(jìn)行下一步等。學(xué)生在這個(gè)過程中會(huì)進(jìn)行自我思考，此時(shí)老師與學(xué)生一起分析原因，通過此過程實(shí)際上教師將實(shí)驗(yàn)原理及實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)等知識(shí)傳授給了學(xué)生，這比實(shí)驗(yàn)前填鴨式的講解效果好很多。

（四）設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

出現(xiàn)了問題，分析了問題可能的原因，接下來就是跟著學(xué)生一起設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，對(duì)可能的原因進(jìn)行驗(yàn)證。此時(shí)給學(xué)生講授如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，為什么要這樣設(shè)計(jì)，學(xué)生更能理解實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的過程及原理。

（五）解決問題

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案再次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這個(gè)過程一般能全部或者至少部分解決之前的問題;有時(shí)候也可能產(chǎn)生新的問題。無論是之前未解決的問題還是新產(chǎn)生的問題，再次回到第二步，依次進(jìn)行分析原因—設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)—再次驗(yàn)證等步驟。如此往復(fù)，學(xué)生學(xué)到了相關(guān)知識(shí)與技術(shù)，同時(shí)掌握了分析問題、解決問題的能力。

對(duì)于學(xué)生成績的評(píng)價(jià)方法，之前主要是以期末考試或者實(shí)驗(yàn)報(bào)告成績?yōu)橹饕罁?jù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，筆者改為實(shí)驗(yàn)報(bào)告和實(shí)驗(yàn)總結(jié)，將學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作能力、分析問題和解決問題的能力在最終成績上體現(xiàn)出來。

二、實(shí)例分析

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課共設(shè)計(jì)了8個(gè)子實(shí)驗(yàn)：RNA抽提、核酸電泳、cDNA合成、PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物回收、載體連接轉(zhuǎn)化、陽性克隆鑒定、質(zhì)粒抽提及酶切鑒定。這8個(gè)實(shí)驗(yàn)基本涵蓋了基因克隆全過程。掌握了該過程就基本掌握了分子生物學(xué)最基本的實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)，對(duì)于再學(xué)習(xí)其他分子操作技術(shù)來說會(huì)相對(duì)容易。將實(shí)驗(yàn)中遇到的典型問題進(jìn)行舉例說明。

（一）RNA抽提

該過程研缽的處理事先由課程教輔教師代為處理好;RNA抽提試劑盒是新購入且未開封，且已經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)室研究生使用證明試劑盒可用;研磨過程需要液氮，有一定的危險(xiǎn)性，提前告知他們液氮使用注意事項(xiàng)。在此基礎(chǔ)上，學(xué)生根據(jù)提供的RNA抽提試劑盒的說明書，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟，并完成了第一次抽提實(shí)驗(yàn)。所抽提的RNA電泳結(jié)果（圖 1A）顯示在最上面有一條帶，下面有一條長的拖尾，這個(gè)結(jié)果與之前理論課告訴學(xué)生總RNA的電泳帶形完全不同。問題產(chǎn)生了：為什么這樣？這些帶是什么？哪里出問題了？這個(gè)RNA能用嗎？下一步怎么辦？……

A：第一次RNA抽提電泳圖;B：第二次RNA抽提電泳圖;C：第一次PCR產(chǎn)物電泳;D：第二次PCR產(chǎn)物電泳;泳道1：DL2000markers;泳道2、3：兩個(gè)重復(fù)樣抽提RNA;泳道4、7、10：DL5000markers;泳道5、6：兩個(gè)重復(fù)樣抽提RNA;泳道8、9：兩個(gè)重復(fù)樣抽提RNA后的RT-PCR擴(kuò)增Actin基因;泳道11：基因A PCR產(chǎn)物;泳道12：基因A陰性對(duì)照;泳道13：基因B PCR產(chǎn)物;泳道14：基因B陰性對(duì)照;泳道15：Actin基因PCR產(chǎn)物;泳道16：Actin基因陰性對(duì)照。

分析問題：首先，marker是DL2000，共6條帶，最小100bp，最大2000bp，最亮的帶是750bp，這些條帶是清晰完整的（圖1A，泳道1），因此電泳相關(guān)試劑及電泳過程是沒問題的;上樣緩沖液的藍(lán)色染料，肉眼可見，可監(jiān)測電泳進(jìn)度，該染料仍在膠上，證明無條帶跑出膠;EB熒光染料與核酸結(jié)合后在紫外光激發(fā)可發(fā)射熒光從而查看核酸帶形;RNA電泳應(yīng)該看到的帶從大至小應(yīng)該是28S（約1600bp，最亮）、18S（約800bp）、5S（約100bp，暗或無），而學(xué)生的電泳圖最大的帶位置已經(jīng)超過2000bp，很明顯該條帶是基因組，下面的拖尾是總RNA降解后的一系列片段。因此，抽提的核酸包括DNA、RNA，但RNA容易降解。那么哪里出問題了？讓學(xué)生回想一下操作過程，口罩、手套使用合規(guī)嗎？所有接觸樣品的試劑耗材有去RNAase處理嗎？這些問題只能學(xué)生自己找答案，學(xué)生總結(jié)原因：一是操作不熟練，可能有些細(xì)節(jié)沒注意;二是圍觀的人多，且有交談，可能是唾液中的RNase影響。這個(gè)RNA能用嗎？如果是進(jìn)行RNA定量檢測是沒有完全必要的;因?yàn)楸敬螌?shí)驗(yàn)是進(jìn)行基因克隆，目標(biāo)基因未完全降解就可用。下一步怎么辦？兩手準(zhǔn)備，一是將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行目標(biāo)基因擴(kuò)增;二是根據(jù)自己總結(jié)的問題，重新設(shè)計(jì)方案進(jìn)行RNA抽提。

設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)：一是默認(rèn)目標(biāo)基因RNA未完全降解，繼續(xù)設(shè)計(jì)cDNA反轉(zhuǎn)錄及PCR實(shí)驗(yàn);二是根據(jù)自己找的RNA抽提過程的問題，重新進(jìn)行RNA抽提。

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：學(xué)生首先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及PCR實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)步驟也是學(xué)生自己設(shè)計(jì)的。學(xué)生首先用Actin基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增（理論P(yáng)CR產(chǎn)物276bp），結(jié)果（圖1C）擴(kuò)增出Actin基因，且大小符合預(yù)期，說明RNA確實(shí)含部分未完全降解RNA。在RNA的重新抽提方面，學(xué)生根據(jù)總結(jié)的原因，選中兩個(gè)操作相對(duì)熟練的人進(jìn)行再次RNA抽提，并禁止其他人圍觀交談;同時(shí)再次仔細(xì)閱讀試劑盒說明書，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。第二次RNA抽提試驗(yàn)結(jié)果（圖1B）顯示，其中總RNA的含量明顯好于第一次，說明他們自己總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)是有效果的。

（二）PCR擴(kuò)增

學(xué)生用第一次抽提的有部分降解的RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增Actin基因，結(jié)果（圖1C）成功擴(kuò)增出條帶。學(xué)生興奮地問：“這說明第一次抽提的RNA是可用的吧？”筆者迅速指出他們的設(shè)計(jì)存在的問題：一是由于Actin作為陽性對(duì)照基因表達(dá)量相對(duì)比較高，能PCR擴(kuò)增出Actin基因并不能完全說明第一次抽提的RNA可用，應(yīng)該增加其他目標(biāo)基因;二是Actin基因的理論P(yáng)CR產(chǎn)物僅275bp，有時(shí)無法與引物二聚體區(qū)分開，因此應(yīng)該同時(shí)加上陰性對(duì)照，在這里同時(shí)將陽性對(duì)照、陰性對(duì)照的作用進(jìn)行了詳細(xì)的講解，看得出來學(xué)生有豁然明白的感覺。同時(shí)提醒學(xué)生，從RNA電泳及Actin擴(kuò)增結(jié)果，學(xué)生提RNA的兩個(gè)重復(fù)樣，RNA質(zhì)量一致，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)選其中一個(gè)樣本進(jìn)行即可，節(jié)約時(shí)間與成本。

設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)：學(xué)生根據(jù)他們自己提出的問題及與教師一起分析探討的結(jié)果，再次進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇了基因A（1074bp）、基因B（1181bp）及Actin基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：再次PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1D）顯示，基因A、基因B、Actin均擴(kuò)增出條帶，且三個(gè)基因的陰性對(duì)照無條帶或者含引物二聚體條帶，說明第一次抽提的RNA可以用來進(jìn)行靶標(biāo)基因克隆模板用。學(xué)生已經(jīng)初步具備了分析問題、解決問題的能力。同時(shí)不可避免的，新的問題也產(chǎn)生了，為什么基因A有四條帶（圖1D，泳道11），除了最下面的二聚體帶，其他帶是什么？基因B有三條帶（圖1D，泳道13），除了二聚體帶，其他帶是什么？如何去掉多余的帶？

再次分析問題：對(duì)于基因A（圖1D，泳道11）來說，目標(biāo)條帶是1074bp，最上面的帶與DL5000 marker的最亮的1000bp帶基本持平，因此這條帶就是基因克隆的目標(biāo)條帶;最下面的帶在100bp左右，應(yīng)該是二聚體帶，基因A的陰性對(duì)照也有此帶（圖1D，泳道12），進(jìn)一步說明該帶為二聚體帶;其他兩條帶是非特異擴(kuò)增的雜帶?；駼與基因A情況類似（圖1D，泳道13），只是少一條雜帶而已。雜帶產(chǎn)生的原因是基因克隆要求引物能擴(kuò)增CDS全長，因此引物可供選擇余地小，容易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增的雜帶。至于如何去掉雜帶，有幾種辦法：一是重新設(shè)計(jì)引物，但是對(duì)引物的限制條件仍在，該方法常常不易成功;二是提高PCR步驟中的退火溫度，該方法可部分緩解雜帶問題，常常無法根除;三是進(jìn)行切膠回收，將目標(biāo)條帶單獨(dú)切出來，再進(jìn)行膠回收，該方法同時(shí)可以去除PCR過程加入的酶及其他雜質(zhì)，是目前解決此類問題的常用辦法。通過這樣的方法，讓學(xué)生自己設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)—分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果—找出問題—再次設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)—驗(yàn)證解決問題，如此循環(huán)往復(fù)，完成整個(gè)分子生物學(xué)所設(shè)置的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)。學(xué)生通過自己的摸爬滾打，一邊摸索實(shí)驗(yàn)，一邊解決實(shí)驗(yàn)問題，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作過程印象深刻，對(duì)所學(xué)的知識(shí)也終生難忘，同時(shí)學(xué)會(huì)了分析問題、解決問題的能力。更難能可貴的是學(xué)生對(duì)生命科研探索充滿了熱情，達(dá)到了實(shí)驗(yàn)課程設(shè)計(jì)的初衷。

三、課程考核方法改革

無論是以期末考試為主，還是以實(shí)驗(yàn)報(bào)告為主的考核方法，會(huì)讓記憶能力強(qiáng)、字跡較為工整的學(xué)生占有一定優(yōu)勢，但是這些學(xué)生在動(dòng)手能力方面并不突出。反而是那些平時(shí)理論課成績并不是很好的學(xué)生，表現(xiàn)出較強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)操作能力及分析問題解決問題的能力。

實(shí)驗(yàn)操作能力可通過平時(shí)課堂觀察，那些操作較多的學(xué)生、實(shí)驗(yàn)觀察較仔細(xì)的學(xué)生在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)課程總結(jié)的時(shí)候，會(huì)寫出生動(dòng)、真實(shí)、身臨其境的感受。在總成績的組成部分中，平時(shí)出勤占10%，課堂表現(xiàn)占20%，課程總結(jié)占30%，實(shí)驗(yàn)報(bào)告占40%。提高實(shí)驗(yàn)操作能力及分析問題、解決問題的能力所占的比重，讓真正熱愛本專業(yè)、肯鉆研、動(dòng)手能力強(qiáng)的學(xué)生得高分，鼓勵(lì)大家仿效，提高實(shí)驗(yàn)課程訓(xùn)練效果。從教學(xué)改革的成果來看，大部分學(xué)生較扎實(shí)地掌握了課程實(shí)驗(yàn)相關(guān)的理論與技術(shù)，并具備了一定程度的分析問題、解決問題的能力，增強(qiáng)了他們學(xué)習(xí)與工作的自信心，一部分學(xué)生甚至因此愛上了科研，并投入考研準(zhǔn)備中。

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Exploration on the Teaching Reform of Molecular Biology Experimental Course： Question-oriented Improvement of Students’ Ability to Analyze and Solve Problems

NIU Xiao-leia， b， FENG Shi-penga， b， JIANG Ling-yana， b， WANG Qian-nana， b， CHEN Yin-huac

（a.College of Tropical Crops; b. Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresource; c. School of Life Science， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China）

Abstract： Molecular biology-related knowledge and experimental techniques are the basic knowledge and techniques that biology-relevant undergraduates need to learn well. These theories and techniques will occupy an extremely important position in the students’ future study and wok. Based on several years of teaching experience in Molecular Biology Experimental Course， this paper discusses the reform and exploration of the teaching process and evaluation methods of this course. The reform is based on the problems encountered by students in their process of hands-on experiments in order to promote students’ ability to analyze and solve problems in experiments. Besides， the evaluation methods of this course are also reformed. Our reform can provide references for teaching method and evaluation methods of Molecular Biology Experimental Course for other colleges and universities in the future.

Key words： Molecular Biology Experimental Course; teaching reform; question-oriented