唐莉 隗伏冰 隗洪進(jìn) 劉珮瑜 傘翠平 鐘文彬 劉玉華 郭海珊

外陰陰道假絲酵母菌?。╒ulvovaginal candidiasis，VVC）也稱念珠菌性陰道炎，為最常見(jiàn)外陰陰道感染性疾病之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)［1］，75%婦女一生中至少患過(guò)1 次VVC，6%～9%婦女患有復(fù)發(fā)性VVC（1年內(nèi)有癥狀并經(jīng)真菌學(xué)證實(shí)發(fā)作4 次或以上），而1年內(nèi)發(fā)作次數(shù)不足4 次，不能診斷為復(fù)發(fā)性VVC 者，定義為VVC 再發(fā)［2］?；?6S rDNA 的測(cè)序是近年來(lái)微生態(tài)領(lǐng)域最具突破性的技術(shù)，它提供豐富的全局性物種類(lèi)群信息，可在微生物集群的層面揭示它們之間的相互作用［3］。本文采用16S rDNA 測(cè)序法分析妊娠期再發(fā)性VVC 患者的陰道細(xì)菌多樣性，與妊娠期單純性VVC 患者和健康孕婦的陰道菌群結(jié)果進(jìn)行比較，揭示菌群結(jié)構(gòu)改變與VVC 發(fā)生發(fā)展的相互關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

選取2018年11月至2019年8月期間在東莞市婦幼保健院首次確診為妊娠期VVC 患者36 例和健康孕婦20 例。動(dòng)態(tài)采集36 例妊娠期VVC 患者3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的陰道分泌物（Y）：Y1 為VVC 治療前，Y2 為治療結(jié)束后7日，Y3 對(duì)于再發(fā)患者為首次再發(fā)時(shí)采集（孕24 周內(nèi)），對(duì)于未再發(fā)患者為孕24 周左右采集，如Y2 鏡檢見(jiàn)真菌，Y3 于重復(fù)治療7日后采集。根據(jù)患者3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的陰道分泌物鏡檢結(jié)果將妊娠期VVC 患者分為A 組未再發(fā)組（9 例）、B 組再發(fā)組（14 例）、C 組持續(xù)陽(yáng)性組（13例）。因此，AY1 表示A 組第1 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的所有陰道分泌物，以此類(lèi)推AY2、AY3、BY1、BY2、BY3、CY1、CY2、CY3。

妊娠期VVC 患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡20～40 歲，孕周＜12 周；②臨床癥狀為外陰瘙癢、灼痛，白帶增多等；③體征為外陰潮紅、水腫，陰道內(nèi)見(jiàn)較多白色豆渣樣或凝乳樣分泌物；④實(shí)驗(yàn)室鏡檢發(fā)現(xiàn)念珠菌菌絲或培養(yǎng)有念珠菌生長(zhǎng)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①?gòu)?fù)發(fā)性VVC；②其它陰道炎如細(xì)菌性陰道病、滴蟲(chóng)性陰道炎等；③對(duì)治療藥物過(guò)敏；④排除糖尿病、免疫系統(tǒng)性疾病、惡性腫瘤等各種急慢性疾病。研究期間剔除標(biāo)準(zhǔn)：①隨訪期間出現(xiàn)流產(chǎn)或失訪者；②入組患者治療后鏡檢真菌陽(yáng)性，重復(fù)治療鏡檢真菌轉(zhuǎn)為陰性者。本研究治療使用克霉唑0.5 g（德國(guó)拜耳制藥）單次陰道用藥。研究對(duì)象知情同意，研究經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 標(biāo)本收集

動(dòng)態(tài)采集妊娠期VVC 患者3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的陰道分泌物（Y）?；颊卟扇“螂捉厥?，研究者使用一次性無(wú)菌窺陰器撐開(kāi)陰道，用3 根一次性無(wú)菌陰道拭子分別于陰道壁中下1/3 處輕輕旋轉(zhuǎn)至少10次，保證樣本量充足，然后將其放入含有3 mL 保存液的試管中充分涮洗，室溫下放置1 周內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室提取陰道分泌物基因組DNA。

1.3 基因組DNA 提取

含陰道分泌物的保存液轉(zhuǎn)移至2 mL 離心管中高速離心，去除上清液。加入250 μL Buffer ATL、250 μL Buffer AL 和20 μL Proteinase K 至樣本中，顛倒或渦旋混勻，65℃水浴15～30 min。按照TIANamp Stool DNA Kit（天根生化科技有限公司）說(shuō)明書(shū)操作提取DNA。

1.4 16S rDNA 高通量測(cè)序

將提取到的總DNA 作為模板，并且對(duì)其細(xì)菌16S rDNA V3 區(qū)片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件：98℃變性2 min，35 個(gè)循環(huán)為94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s。擴(kuò)增產(chǎn)物使用Agencourt AMPure XP kit（貝克曼庫(kù)爾特有限公司）進(jìn)行純化，然后在晶芯BioelectronSeq4000 基因測(cè)序儀（北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司）上進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)使用QIIME2［4］軟件（version 2019.10.0）進(jìn)行處理。首先，使用q2-cutadapt 去除PCR 引物序列。然后，使用quality-filter 對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控并過(guò)濾和使用deblur 進(jìn)行數(shù)據(jù)降噪。接著，使用vsearch 按97%相似性進(jìn)行操作單元（operational taxonomic units，OTUs）分析。代表OUT 序列依據(jù)Greengenes 數(shù)據(jù)庫(kù)（v13_8）應(yīng)用feature-classifier 進(jìn)行物種注釋。最后，使用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)分析組間差異菌屬。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用R 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；計(jì)數(shù)資料采用（%）表示；計(jì)量資料采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高通量測(cè)序結(jié)果

共完成128 個(gè)樣品測(cè)序，獲得63 731 465 條Reads，每個(gè)樣品平均497 902 條Reads，最少的樣本為25 418 條Reads。QIIME2 軟件注釋結(jié)果顯示，分別在A 組未再發(fā)組、B 組再發(fā)組、C 組持續(xù)陽(yáng)性組和N 組健康孕婦組中鑒定出542、572、572、418 條OTUs。見(jiàn)圖1。

圖1 不同組間OTUs 的韋恩圖Figure 1 Venn diagram of OTUs among different groups

2.2 細(xì)菌Alpha 多樣性分析

隨著取樣量的增加，各分組中的菌群OTU 趨于穩(wěn)定，提示測(cè)序量較合理，見(jiàn)圖2。各分組及采樣點(diǎn)之間的Alpha 多樣性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（所有分組Kruskal-Wallis p-value=0.45；pairwise Kruskal-Wallis q-value 均大于0.05），見(jiàn)圖3。

圖2 不同分組的稀釋曲線圖Figure 2 Dilution curves of different groups

圖3 不同分組及時(shí)間點(diǎn)的Alpha 多樣性（Shannon 指數(shù)）分布Figure 3 Alpha diversity（Shannon index）distribution for different groups and time points

2.3 物種注釋結(jié)果

在門(mén)水平上，共發(fā)現(xiàn)11 個(gè)門(mén)。A 組未再發(fā)組、B 組再發(fā)組、C 組持續(xù)陽(yáng)性組、N 組健康孕婦組均以厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)占主要比例，分別位列前三位。在屬水平上，共發(fā)現(xiàn)132 個(gè)屬。A組未再發(fā)組中占比超過(guò)0.5%的主要屬類(lèi)，依次為乳桿菌屬64.12%、雙岐桿菌屬6.44%、普雷沃菌屬4.48%、巨球型菌屬0.72%和小桿菌屬0.54%。B 組再發(fā)組中依次為乳桿菌屬70.50%、鏈球菌屬8.56%、小桿菌屬2.02%、普雷沃菌屬0.66%和雙岐桿菌屬0.66%。C 組持續(xù)陽(yáng)性組中依次為乳桿菌屬69.53%、普雷沃菌屬5.79%、鏈球菌屬1.00%和小桿菌屬0.65%。N 組健康孕婦組中依次為乳桿菌屬59.73%、雙岐桿菌屬11.32%和普雷沃菌屬1.46%。見(jiàn)圖4。

圖4 不同分組的細(xì)菌門(mén)和屬水平物種組成Figure 4 The horizontal species composition of the bacterial phylaand genera in different groups

2.4 差異菌屬分析

所有的樣本前三個(gè)主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)分別為厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)，通過(guò)聚類(lèi)分析可以分為兩大類(lèi)，其中第一類(lèi)以厚壁菌門(mén)為主要優(yōu)勢(shì)菌，占75.2%（94/125），而第二類(lèi)以放線菌門(mén)為主要優(yōu)勢(shì)菌，占24.8%（31/125），見(jiàn)圖5、圖6。通過(guò)主成分分析，可知前兩個(gè)組分的解釋度為99.89%。由于第二類(lèi)陰道細(xì)菌譜的樣本在每個(gè)分組中的樣本例數(shù)較少，未能進(jìn)行有效的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，因此，本文主要討論第一類(lèi)樣本。

圖6 兩類(lèi)樣本間菌群豐度比較Figure 6 Comparison of bacterial abundance between 2 groups

在第一類(lèi)的94 個(gè)樣本中，通過(guò)在屬水平的組間對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)差異菌屬。在治療前，AY1 與N組健康孕婦組比較，丙酸桿菌屬和韋榮氏球菌屬豐度顯著增加，勞爾氏菌屬的豐度顯著降低；BY1 與N 組健康孕婦組比較，普雷沃菌屬、放線菌屬、彎曲桿菌屬和嗜胨菌屬豐度顯著降低；CY1 與N 組健康孕婦組比較，韋榮氏球菌屬、孿生球菌屬和小桿菌屬的豐度顯著增加，雙歧桿菌屬豐度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在未再發(fā)組中，AY3 與N 組健康孕婦組比較，巨球型菌屬豐度顯著增加，丙酸桿菌屬豐度顯著增加，與AY1 類(lèi)似；在再發(fā)組中，BY3與健康孕婦組（N 組）比較，普雷沃菌屬、棒桿菌屬、嗜胨菌屬、Finegoldia、Anaerococcus、彎曲桿菌屬、卟啉單胞菌屬顯著降低；在持續(xù)陽(yáng)性組中，CY3 與N組健康孕婦組比較，韋榮氏球菌屬豐度顯著下降，雙歧桿菌屬豐度也下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），考慮個(gè)別樣本差異因素。見(jiàn)表1。乳桿菌屬主要包括卷曲乳桿菌、惰性乳桿菌及其他乳桿菌。N 組健康孕婦組以卷曲乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌，三組妊娠期VVC患者均以惰性乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌。見(jiàn)表2。

表1 差異菌屬分析（±s）Table 1 Analysis of Different Bacteria（±s）

表1 差異菌屬分析（±s）Table 1 Analysis of Different Bacteria（±s）

分組對(duì)比AY1 vs N H BY1 vs N CY1 vs N AY3 vs N BY3 vs N CY3 vs N菌屬丙酸桿菌屬韋榮氏球菌屬勞爾氏菌屬普雷沃菌屬放線菌屬?gòu)澢鷹U菌屬嗜胨菌屬韋榮氏球菌屬雙歧桿菌屬孿生球菌屬小桿菌屬巨球型菌屬丙酸桿菌屬普雷沃菌屬棒桿菌屬嗜胨菌屬Finegoldia Anaerococcus彎曲桿菌屬卟啉單胞菌屬韋榮氏球菌屬雙歧桿菌屬第一類(lèi)（1.64×10-5）±（1.71×10-5）（3.93×10-6）±（9.60×10-6）（2.12×10-6）±（4.39×10-6）（4.17×10-5）±（8.30×10-5）0.00±0.00 0.00±0.00（8.52×10-6）±（2.08×10-5）（6.21×10-3）±（1.39×10-2）（5.28×10-3）±（1.79×10-2）（2.16×10-3）±（4.94×10-3）（1.09×10-2）±（1.16×10-2）（2.02×10-2）±（6.02×10-2）（1.47×10-4）±（4.25×10-4）（1.66×10-2）±（4.43×10-2）（3.66×10-6）±（1.42×10-5）（5.97×10-6）±（1.46×10-5）（1.11×10-5）±（3.33×10-5）（3.43×10-7）±（1.33×10-6）（1.26×10-6）±（4.88×10-6）0.00±0.00（9.33×10-4）±（2.21×10-3）（7.52×10-3）±（2.58×10-2）第二類(lèi)（5.53×10-6）±（1.76×10-5）0.00±0.00 0.00±0.00（1.57×10-2）±（4.30×10-2）（1.75×10-4）±（6.70×10-4）（7.90×10-5）±（1.47×10-4）（1.01×10-4）±（1.42×10-4）0.00±0.00（5.16×10-2）±（2.23×10-1）0.00±0.00（1.34×10-3）±（4.10×10-3）（1.17×10-6）±（5.24×10-6）（5.53×10-6）±（1.76×10-5）（1.57×10-2）±（4.30×10-2）（2.74×10-4）±（6.32×10-4）（1.01×10-4）±（1.42×10-4）（6.98×10-5）±（1.15×10-4）（6.95×10-5）±（1.35×10-4）（7.90×10-5）±（1.47×10-4）（4.69×10-5）±（1.15×10-4）0.00±0.00（5.16×10-2）±（2.23×10-1）6.0 272 5.1 852 5.1 852 10.0 050 6.0 350 5.1 059 4.9 818 8.0 328 6.1 947 5.8 263 4.0 624 4.9 012 4.8 399 8.2 417 7.0 358 6.9 751 5.8 437 3.9 988 3.9 988 3.9 507 5.8 263 0.3 560 P 值0.0 141 0.0 228 0.0 228 0.0 016 0.0 140 0.0 238 0.0 256 0.0 046 0.0 128 0.0 158 0.0 438 0.0 268 0.0 278 0.0 041 0.0 080 0.0 083 0.0 156 0.0 455 0.0 455 0.0 469 0.0 158 0.5 507

表2 不同分組間乳桿菌種屬豐度對(duì)比（±s）Table 2 Comparison of abundance of Lactobacillus species among different groups（±s）

表2 不同分組間乳桿菌種屬豐度對(duì)比（±s）Table 2 Comparison of abundance of Lactobacillus species among different groups（±s）

分組與N 組對(duì)比H P 值N AY1 BY1 CY1 AY3 BY3 CY3菌屬惰性乳桿菌卷曲乳桿菌其他乳桿菌惰性乳桿菌卷曲乳桿菌其他乳桿菌惰性乳桿菌卷曲乳桿菌其他乳桿菌惰性乳桿菌卷曲乳桿菌其他乳桿菌惰性乳桿菌卷曲乳桿菌其他乳桿菌惰性乳桿菌卷曲乳桿菌其他乳桿菌惰性乳桿菌卷曲乳桿菌其他乳桿菌豐度（2.63×10-1）±（4.24×10-1）（3.87×10-1）±（4.24×10-1）（2.40×10-4）±（4.63×10-4）（5.74×10-1）±（5.00×10-1）（1.80×10-1）±（3.69×10-1）（1.01×10-3）±（1.89×10-3）（4.89×10-1）±（4.81×10-1）（2.47×10-1）±（4.29×10-1）（4.17×10-4）±（5.12×10-4）（4.84×10-1）±（4.45×10-1）（1.61×10-1）±（3.48×10-1）（1.05×10-3）±（1.20×10-3）（4.29×10-1）±（4.34×10-1）（2.33×10-1）±（3.73×10-1）（1.32×10-3）±（3.21×10-3）（5.08×10-1）±（4.41×10-1）（1.73×10-1）±（3.43×10-1）（4.51×10-4）±（6.41×10-4）（5.39×10-1）±（4.60×10-1）（1.47×10-1）±（3.15×10-1）（6.99×10-4）±（6.78×10-4）3.1 812 3.9 379 3.6 732 3.9 845 0.8 021 0.3 704 2.5 756 1.2 429 3.9 169 0.9 934 1.7 531 3.9 169 1.7 750 1.2 429 3.9 169 1.7 948 1.4 338 3.9 169 0.0 745 0.0 472 0.0 553 0.0 459 0.3 705 0.1 749 0.1 085 0.2 649 0.0 478 0.3 189 0.1 855 0.1 844 0.1 828 0.1 712 0.1 058 0.1 803 0.2 311 0.0 478

3 討論

女性陰道微生態(tài)是由陰道微生物、內(nèi)分泌系統(tǒng)、陰道解剖結(jié)構(gòu)及陰道局部免疫系統(tǒng)共同組成的生態(tài)系統(tǒng)［5］。本研究通過(guò)16s rDNA 測(cè)序技術(shù)在妊娠期VVC 患者陰道細(xì)菌門(mén)水平發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)為主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，進(jìn)一步在屬水平探討占比最大的乳桿菌屬。乳桿菌屬歸類(lèi)于厚壁菌門(mén)，不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬中的多個(gè)菌種對(duì)維持陰道微生態(tài)具有重要作用［6-7］，其中卷曲乳桿菌具有抑真菌作用，而惰性乳桿菌則可能影響真菌治愈［8-9］，這兩種菌在本研究中為健康孕婦及患病孕婦的差異菌。

本研究發(fā)現(xiàn)陰道細(xì)菌中除了有大量的乳酸桿菌外，還存在一定多樣性的細(xì)菌菌落，這些細(xì)菌豐度的改變可能與念珠菌陰道炎的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后相關(guān)。本研究在C 組持續(xù)感染組中發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌豐度的大幅度減少，在C 組持續(xù)感染組的Y1時(shí)間點(diǎn)中，雙歧桿菌屬的豐度從5%下降到0.5%，而在Y3 時(shí)間點(diǎn)中，豐度仍維持在0.7%。雙岐桿菌屬于生理性有益菌，具有生物屏障、營(yíng)養(yǎng)作用、抗腫瘤作用、免疫增強(qiáng)作用、改善胃腸道功能、抗衰老等多種重要的生理功能［10］。雙岐桿菌與乳桿菌類(lèi)似，能夠抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng)，抵抗病原菌的感染，其產(chǎn)生的醋酸、丙酸、丁酸及乳酸等有機(jī)酸對(duì)于維持陰道PH 值也是非常重要［11-12］。此外，在B組再發(fā)組中發(fā)現(xiàn)普雷沃菌屬在Y1 時(shí)間點(diǎn)中，其豐度較健康孕婦降低，從1.5%下降到0.4%，而在再發(fā)階段（Y3 時(shí)間點(diǎn)），仍然顯著下降。由于BY3 中有一個(gè)樣本的普雷沃菌為15%。排除該樣本后，BY3 中的平均豐度為0.7%。因此，普雷沃菌屬在再發(fā)組中是顯著下降的。普雷沃菌屬是近年來(lái)從類(lèi)桿菌屬中分出的一個(gè)新菌屬，主要聚集于正常人體的口腔、女性生殖道等部位，組成這些部位的正常菌群，是常見(jiàn)的條件致病菌之一［13］，其主要產(chǎn)物是乙酸和琥珀酸及少量的異丁酸、異戊酸和乳酸，健康條件下對(duì)陰道PH 值有調(diào)節(jié)作用［14］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)妊娠期再發(fā)性念珠菌性陰道炎患者及健康孕婦陰道中存在一定多樣性的細(xì)菌群，其中卷曲乳桿菌及惰性乳桿菌為較顯著差異菌。此外，還發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌屬和普雷沃菌屬等差異菌屬，提示這些菌屬豐度的改變可能與疾病的預(yù)后有關(guān)，或許可以作為治療妊娠期VVC的預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)及個(gè)性化治療的靶標(biāo)位點(diǎn)，但其對(duì)疾病預(yù)后的作用及機(jī)制仍需要探索。