程一升 陶壯俊 王蘋(píng)莉

[摘要] 目的 探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療對(duì)缺血再灌注腦損傷大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬的影響。 方法 建立大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型（MCAO）后分為假手術(shù)組、模型組及治療組，治療組灌胃補(bǔ)陽(yáng)還五湯濃煎劑，模型組和假手術(shù)組均灌胃生理鹽水，連續(xù)灌胃7 d。給藥7 d后，采用改良的Berderson行為學(xué)評(píng)分方法對(duì)大鼠進(jìn)行評(píng)分觀察神經(jīng)功能損傷情況，氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色觀察腦梗死面積，qPCR檢測(cè)腦組織葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78 kD，GRP78）、蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，elF2α）、自噬相關(guān)基因12 （autophagy related gene 12，ATG12） mRNA表達(dá)情況，透射電鏡檢查腦組織梗死周邊交界區(qū)自噬小體情況，HE染色觀察腦組織病理?yè)p傷。 結(jié)果 模型組大鼠的腦組織損失部分塌陷，硬度差，呈蒼白色;模型組和治療組的Berderson行為學(xué)評(píng)分明顯高于假手術(shù)組（P<0.01），治療組明顯低于模型組（P<0.01）;模型組腦梗死面積較治療組明顯增多（P<0.01）;與模型組比較，治療組的GRP78、PERK、elF2α、ATG12 mRNA表達(dá)明顯減少（P<0.05）;治療組自噬小體數(shù)量較模型組明顯減少;治療組病理?yè)p傷較模型組明顯減輕。 結(jié)論 補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以改善大鼠腦缺血再灌注腦損傷，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬發(fā)揮作用。

[關(guān)鍵詞] 缺血再灌注腦損傷;補(bǔ)陽(yáng)還五湯;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;自噬

[中圖分類(lèi)號(hào)] R255.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）11-0034-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of Buyang Huanwu Decoction on endoplasmic reticulum stress and autophagy in rats with ischemia-reperfusion brain injury. Methods The rat model of middle cerebral artery occlusion （MCAO） was established and divided into sham operation group， model group， and treatment group. The treatment group was intragastrically administered with Buyang Huanwu concentrated decoction. The model group and sham operation group were intragastrically administered with normal saline. They were intragastrically administered for seven consecutive days. After seven days of the administration， the neurological impairment of rats was observed by the modified Berderson behavioral scoring method. The cerebral infarction area was observed by 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride （TTC） staining. The mRNA expression of glucose regulated protein 78 kD （GRP78）， protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase （PERK）， eukaryotic initiation factor 2α （elF2α）， and autophagy-related gene 12 （ATG12） in brain tissue was detected by qPCR. The autophagosomes at the peri-infarct junction of brain tissue were examined by transmission electron microscopy. The pathological damage of brain tissue was observed by HE staining. Results The brain tissue loss area of rats in the model group was collapsed with poor hardness and pale color. The Berderson behavioral score in the model group and the treatment group was significantly higher than that in the sham operation group（P<0.01）. And the Berderson behavioral score in the treatment group was significantly lower than that in the model group （P<0.01）. The cerebral infarction area in the model group was significantly higher than in the treatment group（P<0.01）. Compared with the model group， the expression of GRP78， PERK， elF2α， and ATG12 mRNA in the treatment group was significantly reduced（P<0.05）. The number of autophagosomes in the treatment group was significantly reduced; the pathological injury in the treatment group was significantly alleviated. Conclusion Buyang Huanwu Decoction can improve cerebral ischemia-reperfusion brain injury in rats， and the mechanism may be through the regulation of endoplasmic reticulum stress-autophagy.25FD6154-391F-4604-85A4-A6BA1E8ED898

[Key words] Ischemia-reperfusion brain injury; Buyang Huanwu Decoction; Endoplasmic reticulum stress; Autophagy

缺血性腦損傷是各種原因造成腦組織缺血、缺氧引發(fā)的神經(jīng)功能缺損的常見(jiàn)急性腦血管疾病，是全世界成年人第二死因與第一致殘?jiān)騕1]。缺血性腦損傷會(huì)導(dǎo)致患者的運(yùn)動(dòng)功能障礙和認(rèn)知功能異常，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。而腦缺血再灌注后，腦組織損傷程度會(huì)出現(xiàn)迅速加劇的現(xiàn)象，從而進(jìn)一步加重患者的病情，但再灌注是局灶性腦缺血恢復(fù)腦神經(jīng)功能的基礎(chǔ)，所以減輕再灌注損傷、保護(hù)腦組織神經(jīng)元功能至關(guān)重要。有研究表明，缺血再灌注腦損傷與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬密切相關(guān)[2-4]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯最早見(jiàn)于清·王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，由黃芪、赤芍、當(dāng)歸尾、川芎、桃仁、紅花、地龍7味中藥組成，具有益氣活血通絡(luò)的作用。研究表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)缺血性腦損傷具有顯著的改善作用[5-7]。但其具體機(jī)制尚不明確。因此，本研究在制備大鼠MCAO模型的基礎(chǔ)上，研究補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬的影響及其改善缺血再灌注腦損傷的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡的SPF級(jí)SD大鼠30只，體重（230.3±27.2）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SYXK（浙）2013-0184。于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)，室溫18～23 ℃，濕度65%～70%，自由飲水、攝食。經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[倫研批第（2021-HS2）]。

1.2 藥物

補(bǔ)陽(yáng)還五湯組方：黃芪120 g，當(dāng)歸6 g，赤芍4.5 g，桃仁3 g，紅花3 g，地龍3 g，川芎3 g。上述藥物煎煮2次，合并后濃縮成生藥濃度為2 g/ml，4 ℃冰箱避光冷藏備用。

1.3 主要試劑及儀器

Trizon Reagent（批號(hào)：9109），TAKARA公司;熒光定量PCR試劑（批號(hào)：RR420A），TAKARA公司;伊紅染色液（G1100），北京索萊寶科技有限公司;Scott藍(lán)化液（G1865），北京索萊寶科技有限公司;MOG線栓（2838-A5），北京西濃科技有限公司;低溫高速離心機(jī)（5424R），德國(guó)Eppendorf公司;LightCycler 96 SW 1.1型定量PCR儀（美國(guó)Roche公司）;藥品冷藏柜（BYC-310，山東博科生物）;顯微鏡（BX43，OLYMPUS）;切片機(jī)（2235），德國(guó)Leica公司;透射電鏡（H-7650），日本日立公司。

1.4 模型制備及分組給藥

使用改良Longa線栓法[8]制備大鼠MCAO模型：SD大鼠術(shù)前禁食12 h，不禁水，經(jīng)2.5%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定，沿大鼠前正中線切開(kāi)頸部皮膚，再沿左側(cè)胸鎖乳突肌內(nèi)緣逐層分離，暴露頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈并結(jié)扎，將線栓插入頸外動(dòng)脈，并經(jīng)大腦中動(dòng)脈進(jìn)入大腦前動(dòng)脈近端，插入深度平均約（18.5±0.5）mm，直至稍感阻力，表明線栓到達(dá)大腦前動(dòng)脈，扎緊備線，固定線栓。缺血1 h后拔出線栓，大鼠麻醉蘇醒后出現(xiàn)站立不穩(wěn)及提尾時(shí)身體向一側(cè)轉(zhuǎn)圈等右側(cè)肢體癱瘓表現(xiàn)，則判定為模型成功。假手術(shù)組僅暴露頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，不做動(dòng)脈結(jié)扎及插線處理。

將造模成功的SD大鼠隨機(jī)分為治療組和模型組，每組各10只。治療組灌胃補(bǔ)陽(yáng)還五湯濃煎劑，假手術(shù)組、模型組均灌胃生理鹽水。灌胃劑量為1 ml/100 g，1次/d，缺血再灌注后1 h即予灌胃給藥，連續(xù)灌胃7 d。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 Berderson評(píng)分? 分4級(jí)。0分：大鼠提尾懸空，前肢未見(jiàn)行為缺陷;1分：大鼠提尾懸空，一側(cè)前肢長(zhǎng)時(shí)間屈曲;2分：大鼠置于墊子上，拖拽尾巴滑動(dòng)無(wú)抵抗，伴前肢屈曲，大鼠自由活動(dòng)時(shí)無(wú)轉(zhuǎn)圈行為;3分：大鼠置于墊子上，拖拽尾巴滑動(dòng)重度無(wú)抵抗，大鼠自由活動(dòng)時(shí)持續(xù)向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈。末次給藥后1 h進(jìn)行測(cè)定，得分越高神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.5.2 腦梗死面積檢測(cè)? 使用氯化三苯基四氮唑（TTC）檢測(cè)大鼠腦梗死面積，大鼠完全麻醉后，心臟灌流20 ml生理鹽水后取腦，保留小腦、腦干和嗅球部分，注意保持腦組織的完整性，置于-20℃約30 min，棄去小腦和嗅球部分，切片并放入2%TTC染液的密閉容器中，37 ℃避光孵育15 min，梗死區(qū)呈灰白色，非梗死區(qū)呈深紅色。在放置4%多聚甲醛溶液中固定24 h，根據(jù)順序正反面拍照。用Image Pro Plus 6.0進(jìn)行分析，按下列公式計(jì)算出大鼠腦梗死的面積。腦梗死面積（%）=腦梗死面積/全腦面積×100%。

1.5.3 qPCR法檢測(cè)大鼠腦組織GRP78、PERK、elF2α、ATG12 mRNA表達(dá)? 用Trizol一步法抽提小鼠CD4+T細(xì)胞總RNA。引物序列如下：GRP78 F：5'- ACGCACTTGGAATGACCCTT -3'，GRP78 R：5'- AAC TGCATGGGTGACCTTCTT-3'，PERKF：5'-ACTCAGA TGGAACGAGTTAGGAC-3'，PERK R：5'-ATGAACTC AAGGAGCGGGAC-3'，elF2αF：5'-AAACAACACTGTC CTGGCAAC-3'，elF2α R：5'-AGGGACATAAACTGCG ACCTT-3'，ATG12F：GACTGTCCAAGCACTCATCG-3'，ATG12 R：5'-CATCACTGCCAAAACACTCATA-3'，β-actin F：5'-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3'，β-actin R：5'-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3'。反應(yīng)條件：變性（95℃，30 s），退火（95℃，5 s），延伸（60℃，30 s），40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取平均值為檢測(cè)結(jié)果。以β-actin作為內(nèi)參基因來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化樣品，以2^（-△△Ct）方法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。25FD6154-391F-4604-85A4-A6BA1E8ED898

1.5.4 透射電鏡觀察大鼠腦組織自噬小體變化? 取小鼠新鮮腦組織，用2.5%戊二醛浸泡，脫水，包埋，固化，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡拍片觀察各組大鼠腦組織自噬小體的變化。

1.5.5 腦組織病理觀察? 將大鼠腦組織用多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片后逐步脫蠟脫水，HE染色，蒸餾水洗滌，封片，光鏡下觀察各組大鼠腦組織病理改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，組內(nèi)采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠造模情況比較

模型組大鼠腦組織塌陷，硬度差，呈蒼白色，且體積比假手術(shù)組略小，梗死部位呈萎縮狀態(tài)，提示造模成功，治療組大鼠相較于模型組大鼠腦組織塌陷明顯減輕，硬度改善，呈淡紅色。見(jiàn)圖1。

2.2? 三組大鼠Berderson行為學(xué)評(píng)分比較

與假手術(shù)組大鼠Berderson行為學(xué)評(píng)分比較，模型組和治療組大鼠行為學(xué)評(píng)分明顯升高（P<0.01），而與模型組比較，治療組大鼠評(píng)分明顯下降（P>0.01）。見(jiàn)表1。

2.3 三組大鼠腦梗死面積比較

與假手術(shù)組大鼠腦梗死面積比較，模型組和治療組大鼠腦梗死面積明顯增多（P<0.01），而與模型組比較，治療組大鼠腦梗死面積明顯減少（P>0.01）。見(jiàn)表2、圖2。

2.4三組大鼠腦組織GRP78、PERK、elF2α、ATG12 mRNA表達(dá)情況比較

與假手術(shù)組比較，模型組和治療組的GRP78、PERK、elF2α、ATG12的含量均升高 （P<0.05），與模型組比較，治療組的GRP78、PERK、elF2α、ATG12含量明顯減少（P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.5 三組大鼠腦組織自噬小體變化比較

假手術(shù)組中的大鼠基本無(wú)自噬小體形成，模型組和治療組中的大鼠均可見(jiàn)雙層膜包裹的自噬小體，其電子密度較高，與模型組比較，治療組大鼠自噬小體數(shù)量明顯減少。見(jiàn)圖3。

2.6? 三組大鼠腦組織病理比較

假手術(shù)組大鼠腦組織細(xì)胞清晰完整，分布均勻。而模型組和治療組大鼠部分細(xì)胞核緊密相鄰，部分細(xì)胞核松散。與模型組比較，治療組大鼠腦組織細(xì)胞較模型組分布均勻且細(xì)胞核較致密，提示治療組大鼠腦組織病理?yè)p傷減輕。見(jiàn)封三圖1。

3 討論

缺血性腦卒中為臨床最常見(jiàn)的腦血管疾病之一，具有較高的致殘率和致死率。因此在臨床救治中，常采取擴(kuò)張血管、恢復(fù)血供和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給等策略，但在施行救治措施時(shí)往往造成腦缺血再灌注損傷，其發(fā)病過(guò)程與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬密切相關(guān)[9-11]。自噬是細(xì)胞內(nèi)重要的分解代謝途徑，通過(guò)雙膜結(jié)構(gòu)包裹隔離并與溶酶體融合，降解異常折疊的蛋白質(zhì)及細(xì)胞組分，清除破壞的細(xì)胞器，“回收”氨基酸、核苷酸等物質(zhì)供給細(xì)胞進(jìn)行能量循環(huán)利用，是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要手段之一[12-13]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是指當(dāng)細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)遭到破壞時(shí)，蛋白質(zhì)無(wú)法正確進(jìn)行合成及折疊修飾，此時(shí)細(xì)胞通過(guò)一系列的適應(yīng)途徑對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂作出快速反應(yīng)，具有維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)作用，因此適度的ERS可起到保護(hù)細(xì)胞的作用[14]。但持續(xù)的ERS會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，細(xì)胞就會(huì)激活細(xì)胞自噬誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過(guò)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）的激活以保護(hù)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)所引起的細(xì)胞損傷，恢復(fù)細(xì)胞功能[15]。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生、發(fā)展的最重要的標(biāo)志因子，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的分子伴侶，被認(rèn)為是ERS最敏感的標(biāo)志物，可以折疊內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蛋白質(zhì)，并通過(guò)結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2+，發(fā)揮維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的作用[16]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，GRP78與未折疊蛋白結(jié)合，將UPR信號(hào)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)傳導(dǎo)到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核[17]。PERK作為一種典型的UPR信號(hào)通路內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器，在非應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，PERK二聚體位點(diǎn)被GRP78遮蓋，當(dāng)應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，GRP78可與PERK發(fā)生解離，PERK形成寡聚體，激活自身磷酸化，活化的PERK可特異性地磷酸化eIF2α，而磷酸化的eIF2α可促進(jìn)編碼轉(zhuǎn)錄因子ATG12表達(dá)，促進(jìn)自噬體的成熟[18-19]。ATG12是自噬體形成的關(guān)鍵基因，參與自噬體前體形成，其表達(dá)水平可反映自噬程度[20]。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯是清代名醫(yī)王清任的經(jīng)典名方，主要用于缺血性腦卒中及其后遺癥的治療。補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血再灌注損傷的腦保護(hù)作用在以往文獻(xiàn)中報(bào)道較多，對(duì)其保護(hù)機(jī)制的研究亦有較多報(bào)道[21]，但其對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬的影響的研究則相對(duì)較少，故本研究首先采用經(jīng)典的線栓法制作腦缺血再灌注損傷模型，通過(guò)行為學(xué)評(píng)分、腦梗死面積及腦組織HE染色發(fā)現(xiàn)模型大鼠出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能損傷及腦組織損傷，而應(yīng)用補(bǔ)陽(yáng)還五湯后上述變化均得到明顯逆轉(zhuǎn)，這與過(guò)往研究相符合。PCR結(jié)果也顯示補(bǔ)陽(yáng)還五湯可下調(diào)GRP78、PERK、elF2α、ATG12等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬相關(guān)基因的表達(dá)。且本研究通過(guò)透射電鏡觀察各組自噬體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯可顯著減少大鼠缺血側(cè)腦組織自噬體的形成。

綜上所述，補(bǔ)陽(yáng)還五湯改善腦缺血再灌注損傷的機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬發(fā)揮作用。

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（收稿日期：2021-04-19）25FD6154-391F-4604-85A4-A6BA1E8ED898