氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測定葡萄酒中甲醇

甲醇是酒中的有害成分，人體過多攝入含有甲醇的酒會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼部損傷和代謝性酸中毒等，因此測定酒中的甲醛含量十分重要。國家標(biāo)準(zhǔn)《葡萄酒》（GB/T 15037-2006）對不同產(chǎn)品類型葡萄酒中甲醇做出限量規(guī)定，白葡萄酒和桃紅葡萄酒中甲醇的限量為250mg/L，紅葡萄酒中甲醇的限量為400mg/L，檢測方法采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中甲醇的測定》（GB 5009.266-2016）。由于本實(shí)驗(yàn)室使用的色譜柱與國標(biāo)中的規(guī)格不一致，通過試驗(yàn)最終得出適合本色譜柱的分析方法——?dú)庀嗌V內(nèi)標(biāo)法，該方法簡化了國標(biāo)中標(biāo)準(zhǔn)工作液的配置步驟和樣品前處理的制備步驟，使得葡萄酒中甲醇測定更加簡單、快捷。

一、材料與方法

1.材料與試劑。甲醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司，證書編號：GBW（E）082258b、批號：A2003047、濃度：6000μg/mL）;甲醇純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（中國計(jì)量院，證書編號：GBW06111、批號：15002）;叔戊醇純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司，批號：4062003）;色譜純無水乙醇;實(shí)驗(yàn)室用一級水。

2.儀器與設(shè)備。6890氣相色譜儀（FID檢測器）配自動(dòng)進(jìn)樣器;sp型氫空氣發(fā)生器;AUY220型島津分析天平。

3.實(shí)驗(yàn)方法。（1）色譜條件。LZP-930白酒分析柱（25m*0.32mm，1.0μm）;柱溫箱程序升溫：40℃保持7min，10℃/min升溫至50℃，保持8min，10℃/min升溫至150℃，保持2mim;流速為0.8mL/min，分流比為30：1，進(jìn)樣量為1μL;進(jìn)樣口溫度：220℃;FID檢測器溫度：250℃;氫氣流量：40mL/min，空氣流量：450mL/min，氮?dú)馕泊盗髁浚?0mL/min。

（2）甲醇系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的配置。分別吸取甲醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（濃度6000μg/mL，規(guī)格2mL）0.02mL、0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL于5mL容量瓶中，用40%乙醇溶液定容至刻度，配制成甲醇含量為24mg/L、60mg/L、120mg/L、240mg/L、360mg/L、480mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入0.10mL叔戊醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（20000mg/L），混勻后備用。

為了驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性，按照國標(biāo)配置方法，用甲醇純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配置甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（5000mg/L），分別吸取0.125mL、1.00mL、2.00mL于25mL容量瓶中，用40%乙醇溶液定容至刻度，配置成甲醇含量為25mg/L、200mg/L、400mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。吸取5.00mL甲醇標(biāo)準(zhǔn)工作液于試管中，加入0.10mL叔戊醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后備用。

（3）樣品的前處理。吸取100mL試樣于500mL蒸餾瓶中，并加入50mL水（國家標(biāo)準(zhǔn)中此處加入100mL水），加幾顆玻璃珠，連接冷凝管，用100mL容量瓶作為接收器（外加冰?。㈤_啟冷卻水，緩慢加熱蒸餾，收集餾出液，當(dāng)接近刻度時(shí)取下容量瓶，置于20℃水浴中恒溫，用水定容至刻度（國家標(biāo)準(zhǔn)中此處為待溶液冷卻到室溫后定容），混勻。取蒸餾后的溶液于5mL容量瓶中至刻度，加入0.10mL叔戊醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后備用。

將樣品溶液注入氣相色譜儀中，以保留時(shí)間定性，記錄樣品中甲醇和叔戊醇峰面積比值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品中甲醇的濃度。

二、結(jié)果與討論

1.色譜條件的優(yōu)化。按照色譜柱說明書上的色譜分析條件，葡萄酒樣品中甲醇和其他組分不能得到良好的分離。通過設(shè)置不同的程序升溫及流速，最終優(yōu)化了色譜條件，將樣品中組分分開。其中，甲醇出峰時(shí)間是4.636min，叔戊醇出峰時(shí)間是13.212min。

分析甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，柱溫箱：40℃保持7min，10℃/min升溫至50℃，保持8min，采集時(shí)間為16mim，組分全部走完。分析葡萄酒樣品時(shí)，需將樣品中全部組分流出，柱溫箱：40℃保持7min，10℃/min升溫至50℃，保持8min，10℃/min升溫至150℃，保持2mim，分析時(shí)長為28分鐘。其他分析條件如進(jìn)樣口溫度、檢測器溫度、分流比、流速、進(jìn)樣量等不變。做樣品走序列時(shí)分別編輯甲醇標(biāo)液和葡萄酒樣品各自的分析方法，可以節(jié)省很多分析時(shí)間。

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。以甲醇和叔戊醇濃度比為橫坐標(biāo)，甲醇和叔戊醇峰面積的比值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品檢測需要，甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍選擇在24-480mg/L，線性回歸方程為y=0.5874086x+0.0121842，相關(guān)系數(shù)r2=0.9996。

3.樣品前處理的優(yōu)化結(jié)果。一般測定葡萄酒樣品時(shí)，酒精度也是必測的參數(shù)，兩方法前處理的蒸餾過程相似，本方法采用酒精度的蒸餾液測定甲醇。酒精度測定依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 酒中乙醇濃度的測定》（GB 5009.225-2016）第一法密度瓶法，兩方法的取樣量、收集蒸餾液體積均為100mL，不同之處是蒸餾前的加水體積和蒸餾液的定容溫度，測定酒精度加水50mL，蒸餾液恒溫至20℃后定容;測定甲醇加水100mL，蒸餾液恢復(fù)至室溫后定容。

按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中甲醇的測定》（GB 5009.266-2016）標(biāo)準(zhǔn)中對平行雙樣精密度的要求，在重復(fù)性測定條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不超過其算術(shù)平均值10%。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)比對表明，蒸餾時(shí)加水的體積不同及恒溫至20℃后定容，對甲醇測定結(jié)果無顯著影響。蒸餾一次可用于測定酒精度和甲醇兩個(gè)項(xiàng)目，縮短了蒸餾時(shí)間，省時(shí)省力。測定結(jié)果見表1。

4.方法檢出限與定量限。以3倍信噪比（S/N=3）確定方法檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）確定方法定量限，此色譜分析方法下的7.5mg/L甲醇檢出限溶液信噪比等于11.9，24mg/L甲醇定量限溶液信噪比等于20.5。由此可得，此分析方法滿足標(biāo)準(zhǔn)要求中的檢出限與定量限。

5.準(zhǔn)確度、精密度和加標(biāo)回收率。（1）準(zhǔn)確度的測定。通過標(biāo)物比對的方式驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性，采用甲醇純品配置了低、中、高三個(gè)水平的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液25mg/L、200mg/L、400mg/L，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)曲線測得的濃度值分別為26.2mg/L、198mg/L、396mg/L，符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404-2008）附錄F.5準(zhǔn)確度中濃度值在10-1000mg/kg偏差范圍<15%。國標(biāo)方法中先配置到25mL容量瓶中，再吸取一定體積到試管中后加入叔戊醇混勻，操作繁瑣，混勻不方便。而本實(shí)驗(yàn)的配置方法直接吸取一定量已知濃度的甲醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)直接定容至5mL容量瓶中，后加入叔戊醇混勻，減少一步過程，操作簡便、節(jié)省時(shí)間，且準(zhǔn)確度高。

（2）精密度的測定。在本色譜條件下對低、中、高三個(gè)水平濃度24mg/L、120mg/L、480mg/L的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測定6次，以RSD表示，見表2。

（3）回收率的測定。取龍眼桃紅葡萄酒樣品100mL，分別加入6000μg/mL甲醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.50mL、1.70mL，加50mL水蒸餾，測得加標(biāo)回收率結(jié)果符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404-2008）附錄F.3回收率，被測組分含量在1-100mg/kg回收率范圍在90%-110%。

6.樣品測定結(jié)果。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對當(dāng)?shù)夭煌愋推咸丫茦悠分械募状己窟M(jìn)行測定，符合《葡萄酒》（GB/T 15037-2006）中的要求，檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是樣品含量不受進(jìn)樣體積的影響，但是要確保加入甲醇標(biāo)液和樣品中的叔戊醇的量是準(zhǔn)確一致的。采用自動(dòng)進(jìn)樣器時(shí)進(jìn)樣量相同，理論上標(biāo)液中叔戊醇的峰面積和樣品中的叔戊醇的峰面積是相等的，但實(shí)際實(shí)驗(yàn)中由于操作或者儀器帶來的一些誤差，偶爾也會(huì)出現(xiàn)兩者峰面積差距較大的情況，因此實(shí)驗(yàn)過程中要觀察樣品中內(nèi)標(biāo)叔戊醇的峰面積，如果進(jìn)樣量相同時(shí)相差較大，勢必影響定量的準(zhǔn)確性。一般可以將樣品中甲醇的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線中叔戊醇的面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出甲醇實(shí)際含量，如與儀器測定的含量有顯著差別，超出了標(biāo)準(zhǔn)要求的精密度，需要重新制備甲醇樣品上機(jī)測定。

三、結(jié)論

通過試驗(yàn)優(yōu)化出適合本色譜柱LZP-930白酒分析柱（25m*0.32mm，1.0μm）的葡萄酒分析方法，簡化了國標(biāo)中標(biāo)準(zhǔn)工作液的配置步驟和樣品前處理制備步驟，使得實(shí)際工作中對于葡萄酒中甲醇的測定更加快捷、方便，縮短了檢驗(yàn)時(shí)間，節(jié)省了人工成本。實(shí)驗(yàn)表明，甲醇濃度在24-480mg/L，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9996，線性的準(zhǔn)確度、精密度、加標(biāo)回收率良好。

作者簡介：張?jiān)剑?987-），女，河北張家口人，大學(xué)本科，研究方向?yàn)槭称窓z測。