曹士政，趙登高，馬燕燕，張焜（五邑大學(xué)，廣東 江門 529020）

佛手（Citrus medicaL. var.sarcodactylisSwingle）為蕓香科香櫞屬植物佛手的果實(shí)，具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰的功效，可用于肝胃氣滯、胸脅脹痛、胃脘痞滿、食少嘔吐、咳嗽痰多等癥狀[1]。佛手在中國長江以南多地有栽種，主要分為川佛手、廣佛手和金佛手，其質(zhì)量存在差異。《中國藥典》2020年版采用單一的橙皮苷作為佛手的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，難以對(duì)佛手的整體質(zhì)量進(jìn)行全面控制與準(zhǔn)確評(píng)價(jià)。研究表明，除橙皮苷外，可增加6，7-二甲氧基香豆素、香葉木苷、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑內(nèi)酯和水合氧化前胡素等5 個(gè)成分作為佛手的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)[2-4]。

一測(cè)多評(píng)（QAMS）法通過建立各個(gè)組分與內(nèi)參物之間的相對(duì)校正因子，可實(shí)現(xiàn)多組分的一測(cè)多評(píng)[5]。QAMS 法不僅可以同時(shí)檢測(cè)多指標(biāo)成分，還能降低實(shí)驗(yàn)成本和檢測(cè)周期[6]。目前佛手中化學(xué)成分的含量測(cè)定大多采用外標(biāo)法[7-11]，實(shí)驗(yàn)操作過程煩瑣，所需對(duì)照品價(jià)格昂貴。因此，本研究基于超高效液相色譜（UPLC）技術(shù)，建立了QAMS 法，測(cè)定佛手中5，7-二甲氧基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素和佛手柑內(nèi)酯的含量，為提升佛手的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相系統(tǒng)（美國Waters 公司），KQ-500VDB 型超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司），SQP 電子天平（賽多利斯公司）。

1.2 試藥

佛手藥材于2021年購入，共15 批，由五邑大學(xué)生物科技與大健康學(xué)院馬燕燕教授鑒定為蕓香科植物佛手（Citrus medicaL.var.sarcodactylisSwingle）的干燥果實(shí)，詳細(xì)信息見表1；6，7-二甲氧基香豆素（批號(hào)：PS020517）、橙皮苷（批號(hào)：PS011588）、香葉木苷（批號(hào)：PS020083）、水合氧化前胡素（批號(hào)：PS001249）、5，7-二甲氧基香豆素（批號(hào)：PS021023）、佛手柑內(nèi)酯（批號(hào)：PS002115）（對(duì)照品，純度≥98%，成都普思生物科技有限公司）；甲醇（色譜級(jí)，默克），乙腈（色譜級(jí)，賽默飛世爾），水為超純水。

表1 樣品信息Tab 1 Source information of the samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Fisher Scientific HypersII GOLD-C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）， 流速0.4 mL·min-1，進(jìn)樣量2 μL，柱溫40℃，檢測(cè)波長為330 nm，流動(dòng)相：乙腈溶液（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～2 min，10%A；2 ～12 min，10% ～15%A；12 ～17 min，15%A；17 ～17.5 min，15% ～17.2%A；17.5 ～33 min，17.2% ～25%A；33 ～53 min，25% ～75%A；53 ～54 min，75%～95%A；54 ～58 min，95%A；58～59 min，95%～10%A，59～62 min，10% A）。混合對(duì)照品與待測(cè)樣品的色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品（A）及待測(cè)樣品（B）色譜圖Fig 1 Chromatogram of mixed reference substance（A）and sample（B）

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取對(duì)照品6，7-二甲氧基香豆素 1.01 mg，橙皮苷1.06 mg，香葉木苷 1.04 mg，水合氧化前胡素1.03 mg，5，7-二甲氧基香豆素 1.09 mg，佛手柑內(nèi)酯 1.03 mg，分別用甲醇均配成1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。吸取各對(duì)照品溶液適量用甲醇稀釋，制成100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 μg·mL-1梯度濃度的系列線性溶液，4℃冷藏靜置備用。

2.3 供試品溶液制備

在25 mL 量瓶中加入佛手果粉末2 g，加入25 mL 甲醇后35 ℃超聲（功率500 W，頻率45 kHz）45 min，冷卻后定容。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性關(guān)系考察 將“2.2”項(xiàng)下制備的對(duì)照品梯度系列線性溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制各對(duì)照品的回歸方程，信噪比S/N＝10 時(shí)求定量限，信噪比S/N＝3 時(shí)求檢測(cè)限，結(jié)果表明，各化合物在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，結(jié)果見表2。

表2 佛手中6 種成分線性方程、線性范圍、檢測(cè)限和定量限Tab 2 Linear equation，linearity，detection limit and quantification limit of 6 components in Citrus medica

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液2 μL，連續(xù)測(cè)定6 次，計(jì)算得各樣品的日間和日內(nèi)峰面積RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、24、48 h 進(jìn)樣測(cè)定。6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.69%、0.70%、1.9%、0.62%、0.40%、1.0%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.3”項(xiàng)下方法制備佛手供試品溶液6 份，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑內(nèi)酯峰面積的RSD分別為2.0%、2.7%、2.3%、2.9%、1.3%、2.7%，表明樣品重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn) 稱量佛手樣品6 份，加入含量相同的對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，求得6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑內(nèi)酯的平均加樣回收率（n＝6）分別為104.22%、105.36%、100.58%、102.18%、114.85%、100.06%，RSD分別為2.2%、2.1%、2.6%、2.2%、2.7%、0.38%，表明該方法回收率良好。

2.5 相對(duì)校正因子fs/i 的建立

本試驗(yàn)采用多點(diǎn)矯正法。根據(jù)fs/i＝fs/fi＝As×Ci/（Ai×Cs）計(jì)算QAMS 的fs/i，式中fs/i為內(nèi)標(biāo)物對(duì)待測(cè)組分i的校正因子，As為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)物濃度，Ai為待測(cè)組分i峰面積，Ci為待測(cè)組分i濃度。以5，7-二甲氧基香豆素為內(nèi)參物，根據(jù)公式分別計(jì)算6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯的fs/i。

2.6 fs/i 耐用性評(píng)價(jià)

2.6.1 不同高效液相色譜儀和色譜柱對(duì)fs/i的影響分別考察了Waters ACQUITY UPLC H-Class、Aglient 1290 UPLC 兩種高效液相色譜儀和Thermo Fisher Scientific HypersII GOLD-C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）、Shim pack GLSS C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）、Supelco Titan C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）三種色譜柱對(duì)fs/i的影響，結(jié)果顯示6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、佛手柑內(nèi)酯在不同高效液相色譜儀和不同色譜柱上的fs/i的RSD分別為1.0%、2.5%、2.8%、2.6%、1.4%，均小于3%，單因素ANOVA檢驗(yàn)顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明不同高效液相色譜儀和不同色譜柱對(duì)各成分的fs/i無明顯影響。

2.6.2 不同進(jìn)樣體積對(duì)fs/i的影響 分別精密吸取不同體積（0.6、1、1.3、1.6、2 μL）的混合對(duì)照品溶液，依次注入高效液相色譜儀中進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜峰峰面積，考察不同進(jìn)樣體積對(duì)fs/i的影響，結(jié)果表明，進(jìn)樣體積的改變對(duì)佛手各成分fs/i無明顯影響，6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑內(nèi)酯fs/i的RSD依次為1.2%、1.4%、1.4%、2.0%、0.94%，均小于2.5%，單因素ANOVA 檢驗(yàn)顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明不同進(jìn)樣體積對(duì)各成分的fs/i無明顯影響。

2.6.3 不同色譜柱柱溫對(duì)fs/i的影響 采用Waters ACQUITY UPLC H-Class，Thermo Fisher Scientific HypersII GOLD-C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm），分別使用不同柱溫（25、30、35、40、45 ℃）對(duì)混合對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，柱溫的改變對(duì)佛手6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑內(nèi)酯fs/i無明顯影響，各成分fs/i的RSD依次為1.5%、1.7%、2.4%、1.5%、1.0%，均小于2.5%，單因素ANOVA 檢驗(yàn)顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明不同色譜柱柱溫對(duì)各成分的fs/i無明顯影響。

2.6.4 不同流速對(duì)fs/i的影響 分別使用不同流速（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL·min-1）對(duì)混合對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜峰峰面積，考察不同流速對(duì)fs/i的影響。結(jié)果表明，流速的改變對(duì)佛手各個(gè)成分fs/i無明顯影響，6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑內(nèi)酯fs/i的RSD依次為1.8%、2.2%、1.0%、1.9%、1.9%，均小于2.5%，單因素ANOVA 檢驗(yàn)顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明不同流速對(duì)各成分的fs/i無明顯影響。

2.6.5 不同檢測(cè)波長對(duì)fs/i的影響 分別使用不同波長（328、329、330、331、332 nm）對(duì)混合對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜峰峰面積，考察不同檢測(cè)波長對(duì)fs/i的影響。結(jié)果表明，檢測(cè)波長的改變對(duì)佛手各個(gè)成分fs/i無明顯影響，6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑內(nèi)酯fs/i的RSD依次為2.8%、1.7%、2.7%、2.6%、2.7%，均小于3%，單因素ANOVA 檢驗(yàn)顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明不同檢測(cè)波長對(duì)各成分的fs/i無明顯影響。

2.6.6 不同操作人員對(duì)fs/i的影響 不同操作人員按照“2.2”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別對(duì)混合對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜峰峰面積，考察不同操作人員對(duì)fs/i的影響。結(jié)果表明，操作人員的改變對(duì)佛手各個(gè)成分fs/i無明顯影響，6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑內(nèi)酯fs/i的RSD依次為2.2%、1.1%、2.6%、0.85%、1.9%，均小于3%，單因素ANOVA 檢驗(yàn)顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明不同操作人員對(duì)各成分的fs/i無明顯影響。

2.7 待測(cè)成分的色譜峰定位

通過計(jì)算在不同色譜儀和不同色譜柱中，佛手各組分的色譜峰與5，7-二甲氧基香豆素色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間（ts/i），對(duì)各待測(cè)組分進(jìn)行定位，結(jié)果不同儀器與色譜柱測(cè)得的ts/i的RSD均小于2.5%，表明可以以ts/i對(duì)佛手中各組分的色譜峰進(jìn)行定位。

2.8 QAMS 與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的比較

取15 批佛手藥材粉末制成樣品溶液，精密吸取2 μL 注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。分別采用QAMS 法和外標(biāo)法計(jì)算15 批佛手中6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素、5，7-二甲氧基香豆素、佛手柑內(nèi)酯的含量，每批3 份，結(jié)果見表3。將QAMS 法與外標(biāo)法測(cè)得的各組分含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法測(cè)得的6 種組分含量基本一致，RSD均小于3%。單因素ANOVA 檢驗(yàn)分析結(jié)果表明，QAMS 法與外標(biāo)法所得結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明該QAMS 法可以替代外標(biāo)法用于佛手藥材的含量測(cè)定。

表3 QAMS 法與外標(biāo)法測(cè)得15 批佛手中6 種成分的含量(mg·g-1，n ＝3)Tab 3 Contents of 6 components in 15 batches of Citrus medica measured by QAMS method and ESM (mg·g-1，n ＝3)

2.9 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

為了解這15 批來源不同的佛手藥材的差異，本研究進(jìn)行了指紋圖譜的考察。將15 批佛手藥材按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，將15 批樣品指紋圖譜的CDF 數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 版），進(jìn)行相似度計(jì)算，設(shè)置樣品S12圖譜為參照?qǐng)D譜，根據(jù)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)的操作規(guī)范2004A，采用中位數(shù)法產(chǎn)生對(duì)照指紋圖譜，時(shí)間窗寬度為0.1，由19 個(gè)峰校正，自動(dòng)匹配，生成對(duì)照指紋圖譜（見圖2），其相似度結(jié)果見表4。15 批佛手的相似度均大于0.94，這表明不同產(chǎn)地的佛手藥材具有較高的一致性。四川安岳與廣西桂林的相似度較差，可能與藥材的質(zhì)量有關(guān)。

表4 不同產(chǎn)地佛手的相似度Tab 4 Similarity of Citrus medica from different regious

圖2 15批佛手的UPLC 指紋圖譜Fig 2 UPLC fingerprints of 15 batches of Citrus medica

2.10 聚類分析

以不同產(chǎn)地佛手樣品的19 個(gè)峰含量為變量，采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)15 批佛手藥材進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。采用組間聯(lián)接的聚類方法，選取歐式距離平方和作為樣本測(cè)度。當(dāng)歐式距離平方和為15 時(shí)，佛手藥材可以分為3 類，Ⅰ類為S1，S11，S12，S14，S3，S9，S13；Ⅱ類為S2，S7；Ⅲ類為S4，S10，S6，S5，S8，S15。上述結(jié)果與相似度評(píng)價(jià)一致，相同產(chǎn)地不同批次樣品間差異較小，浙江金華與廣東的佛手比較相似，四川、云南、廣西、重慶的佛手比較相似。推測(cè)影響分類的結(jié)果可能與藥材產(chǎn)地的緯度、氣候及土壤等有一定聯(lián)系。

圖3 15批佛手指紋圖譜聚類分析Fig 3 Cluster analysis of fingerprints of 15 batches of Citrus medica

3 討論

與HPLC 法相比，UPLC 法具有靈敏度高、線性范圍寬、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，本試驗(yàn)的線性范圍達(dá)到了0.05 ～100 μg·mL-1，定量限和檢測(cè)限分別達(dá)到了0.05 和0.025 μg·mL-1，表明本方法具有較高的靈敏度和較寬的線性范圍。本試驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行了190 ～400 nm 全波長掃描，比較各波長下色譜圖，各成分在330 nm 處均有較大吸收。因此本試驗(yàn)選用330 nm 為檢測(cè)波長。

鐘艷梅等[4]研究顯示，香豆素類成分的含量差異是區(qū)分佛手藥材的關(guān)鍵指標(biāo)。佛手中的香豆素類成分具有多種生物活性，水合氧化前胡素具有抗炎、抗腫瘤等活性、6，7-二甲氧基香豆素具有止喘及降血壓作用[12]，佛手柑內(nèi)酯具有催眠抗腫瘤等活性[14]。因此，本試驗(yàn)在橙皮苷的基礎(chǔ)上，增加水合氧化前胡素等香豆素類化合物作為指標(biāo)，建立更全面、快速、高效的多組分含量測(cè)定方法。

佛手在我國南方多地均有栽培，根據(jù)產(chǎn)地的不同，佛手可分為川佛手、廣佛手、金佛手。本研究聚類分析表明，東南地區(qū)的廣東佛手和浙江佛手聚為一類，西南地區(qū)的四川、云南和廣西佛手聚為一類。說明不同地域的佛手雖有差異，但亦有相同之處。

綜上所述，本試驗(yàn)采用UPLC 技術(shù)建立了以5，7-二甲氧基香豆素為內(nèi)參物的QAMS 法，用于測(cè)定佛手中5，7-二甲氧基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷、香葉木苷、水合氧化前胡素和佛手柑內(nèi)酯等6 種化學(xué)成分的含量，該方法操作簡便，精密度高，穩(wěn)定性、重復(fù)性好，為全面評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地佛手的質(zhì)量提供了參考根據(jù)。