肖劍虹，趙正宜，鄒多宏,2

作者單位：1安徽醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，安徽醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，安徽省口腔疾病研究重點實驗室，合肥 2300322上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學院口腔外科，上海市口腔醫(yī)學重點實驗室，上海 200001

引導骨再生(guided bone regeneration, GBR)技術(shù)是臨床上治療牙槽骨缺損常用且有效的方法之一。其中，GBR屏障膜在阻止成纖維細胞和上皮細胞等非成骨細胞長入骨缺損區(qū)和維持骨修復所需要的空間等方面起到重要作用。目前臨床上應用的可吸收性屏障膜機械強度不足，在骨缺損修復的過程中容易發(fā)生穿孔和破裂，不利于屏障功能的實現(xiàn)和骨修復空間的維持，從而導致骨修復效果不佳[1]。因此，研發(fā)出一種具有足夠力學性能的屏障膜，尤其是在體內(nèi)濕態(tài)環(huán)境下還能維持足夠的力學強度，以維持骨再生所需要的空間是目前發(fā)展GBR技術(shù)的當務之急。該研究在殼聚糖(chitosan, CS)基質(zhì)中引入細菌纖維素(bacterial cellulose, BC)，并通過自蒸發(fā)方法制備出CS-BC復合膜，通過測試該復合膜在干態(tài)和濕態(tài)下的拉伸強度及其對大鼠骨髓干細胞增殖的影響，探究其作為GBR膜的可行性。

1 材料與方法

1.1 合成材料中低黏度CS(100～200 Mpa.s，脫乙酰度≥95%，阿拉丁生化科技股份有限公司，上海)。細菌纖維素(生化級，阿拉丁生化科技股份有限公司，上海)

1.2 主要試劑與儀器胎牛血清(美國Gbico公司)；達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(美國Gbico公司)；胰酶消化液(美國 Hyclone公司)；CCK-8試劑盒(日本株式會同仁化學研究所)；冰乙酸和氫氧化鈉(北京國藥集團化學試劑有限公司)；二氧化碳孵育箱(美國Thermo公司)；高溫高壓滅菌鍋(HVE-50, 日本Hirayama公司)；酶標儀(美國Bio-tek公司)；超聲破碎機(JYD1800L, 上海比朗儀器有限公司)；力學萬能測試機(5565A, 美國英斯特朗公司)；掃描電子顯微鏡(Supra 40，德國蔡司公司)；透射電子顯微鏡(HT7700, 日本日立公司)；傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet 8700， 美國熱電尼高力儀器公司)；X 射線衍射儀 (X'Pert3 Powder，荷蘭帕納科公司)。

1.3 原料合成稱取1 g CS粉末溶于98 ml去離子水中，邊攪拌邊往溶液中逐滴加入1 ml冰乙酸，攪拌至粉末完全溶解，配制出質(zhì)量濃度為1%的CS溶液，離心除氣泡備用。

1.4 復合膜的制備首先制備CS ∶BC質(zhì)量分數(shù)為10 ∶1的復合膜，取100 g 1% CS溶液和20 g 0.5% BC溶液，冰水浴中超聲破碎至兩者混合均勻，在真空干燥箱中除盡氣泡后倒入培養(yǎng)皿中，放置于40 ℃加熱臺上待水分完全蒸發(fā)后成膜。將自蒸發(fā)所制備的膜浸泡于0.3 mol/L的氫氧化鈉乙醇溶液中24 h，待酸除盡后用去離子水沖洗干凈后一半干燥，另一半在去離子水中浸泡保持濕潤狀態(tài)備用。同理分別制備CS ∶BC質(zhì)量分數(shù)為10 ∶3、10 ∶5、10 ∶7和10 ∶9的復合膜以及純CS膜(圖1)。

圖1 復合膜的制備過程示意圖

1.5 力學性能測試將所制備的各組薄膜在室溫下裁剪為長50 mm、寬3 mm 的樣品(每組薄膜樣品數(shù)量為6)。用螺旋測微器測量每個樣品的厚度后，通過力學測試機在拉伸速度為0.01 mm/s的情況下拉伸樣品至樣品斷裂，并記錄其拉伸強度。每組膜干燥和濕潤的樣品均重復測試6次。繪制出各組膜分別在干態(tài)和濕態(tài)下的拉伸強度值表和應力應變曲線圖，取拉伸強度最大的復合膜組及純CS膜組進行后續(xù)實驗。

1.6 樣品表征取純CS組和拉伸強度最大的復合膜組，用掃描電子顯微鏡觀察其橫截面的微觀結(jié)構(gòu)。將成品BC溶液稀釋后滴于透射銅網(wǎng)的表面，待其完全干燥后經(jīng)透射電鏡觀察BC的形貌。將BC溶液經(jīng)自蒸發(fā)沉積后成膜，取純BC膜、純CS膜和拉伸強度最大的復合膜，采用傅立葉變換紅外光譜儀和X-射線衍射儀分析其各組成分。

1.7 大鼠骨髓干細胞(rat bone marrow stem cells, RBMSCs)的分離及培養(yǎng)取3～4周齡體質(zhì)量為(50±5) g的雄性SD大鼠(安徽醫(yī)科大學實驗動物中心)的兩邊股骨，用眼科剪將股骨兩端剪去成兩端相通，用1 ml的注射器吸取含20%胎牛血清的DMEM反復沖洗骨髓腔、離心、棄上清液后將沉淀的組織細胞重懸于大皿中培養(yǎng)，大皿中總體積為10 ml，標記為P0。5 d后首次換液，之后每3 d換1次液，待P0細胞融合至70%～80%后用胰蛋白酶消化傳代。本實驗所用的大鼠骨髓干細胞均為P3～P5代。

1.8 細胞相容性實驗取純CS組及干濕態(tài)力學性能最強組復合膜，用打孔器將薄膜制備為直徑為6 mm的圓，每組至少15個樣，經(jīng)過高溫高壓滅菌后備用。取P3～P5代RBMSCs，分為空白對照組、純CS膜組和復合膜組共3組，每組5個復孔，共3個時間段以5×103/孔的細胞密度接種于3個96孔板中。在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待孔板中的細胞貼壁后，將滅菌好的薄膜材料分別加入3個96孔板中，空白對照組中不加任何薄膜。繼續(xù)將96孔板置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、4、7 d。將CCK-8試劑與純DMEM以1 ∶10的比例混合后，每孔加110 μl，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用酶標儀讀取每孔在波長為450 nm處的吸光度(optical density, OD)值。

2 結(jié)果

2.1 純CS膜及各組復合膜在干態(tài)和濕態(tài)下拉伸強度的比較各組薄膜在干態(tài)和濕態(tài)下的拉伸強度值和應力應變曲線圖如圖2。隨著BC含量增加，CS-BC復合膜在干濕態(tài)下的拉伸強度隨之增加，在CS ∶BC為10 ∶7時，拉伸強度達到最大，干、濕態(tài)的拉伸強度分別為(204.7±63.0)、(44.4±6.4) MPa，遠遠大于臨床上最常用的Bio-Gide膜在干、濕狀態(tài)下的力學性能約為3.7、1.16 MPa，之后隨著BC含量增加，拉伸強度開始下降。

2.2 樣品表征純CS膜和CS ∶BC質(zhì)量分數(shù)為10 ∶7的復合膜橫截面的掃描圖如圖3所示。純CS膜為均一的有機質(zhì)結(jié)構(gòu)，復合膜中可見BC的纖維撕扯樣結(jié)構(gòu)。透射電鏡示BC的納米纖維樣結(jié)構(gòu)(圖4)。傅立葉變換紅外光譜圖和X-射線衍射圖中示復合膜中存在CS和BC(圖5)。

2.3 細胞相容性實驗選取純CS膜和CS ∶BC質(zhì)量分數(shù)為10 ∶7時的復合膜進行細胞相容性實驗。圖6結(jié)果顯示，純CS組和復合膜組與RBMSCs共培養(yǎng)1 d (F=3.590，P=0.060)、4 d (F=0.293，P=0.751)和7 d (F=1.737，P=0.217)后，在同一個時間段內(nèi)，各組OD值差異無統(tǒng)計學意義?；诖私Y(jié)果，本實驗所制備的復合膜具有優(yōu)良的細胞相容性。

圖2 純CS膜、各組復合膜及Bio-Gide膜在干態(tài)和濕態(tài)下拉伸強度的比較

圖3 橫截面掃描電鏡微觀結(jié)構(gòu)圖

圖4 BC在不同倍數(shù)下的透射電鏡圖

圖5 CS-BC復合膜的傅立葉變換紅外光譜圖

圖6 各組膜材料與RBMSCs共培養(yǎng)1、4和7 d后細胞計數(shù)的比較

3 討論

臨床上，GBR技術(shù)被廣泛應用于因炎癥、創(chuàng)傷、腫瘤摘除或者先天性疾病而引起的牙槽骨缺損的治療[2]。該技術(shù)將一層屏障膜置于骨缺損和軟組織之間來阻擋周圍遷移過快的成纖維細胞和上皮細胞等軟組織細胞長入骨缺損從而確保骨修復正常進行[3-4]。

目前臨床上應用的GBR膜根據(jù)其降解性與否劃分為不可吸收性膜和可吸收性膜。不可吸收性膜具有良好的生物相容性和足夠的機械強度以維持骨缺損修復的空間，但是需要二次手術(shù)取出極大地限制了其臨床應用[5]?？晌招阅ひ蚓哂辛己玫纳锵嗳菪?、可降解性而廣泛應用于臨床。但是可吸收性膜力學性能不足可能會導致骨缺損預后不佳[6]。因此，理想的GBR膜除了應具有良好的生物相容性，還應具備足夠的力學強度，以維持骨缺損修復的空間和防止膜的穿孔破裂?？紤]到GBR膜的實際應用環(huán)境是在體內(nèi)濕態(tài)環(huán)境下，所以GBR膜在濕潤狀態(tài)下的力學性能更是至關(guān)重要。

所以，本研究擬制備出一種具有良好的生物相容性，在干態(tài)和濕態(tài)下具有優(yōu)異力學性能的新型GBR膜。CS因具備良好的生物相容性、可降解性和抑菌性而被廣泛的應用于組織工程[7]。但是純CS力學強度不夠，常通過應用納米復合材料、與聚合物混合以及通過化學交聯(lián)等方法來提高CS的力學性能，但是這些提高CS機械強度的方法會影響到其生物活性，所以，如何做到在不影響CS生物活性的前提下提高其力學強度是當前的一個研究熱點[8-9]。

BC是一種具有三維多孔網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的納米纖維，因具有顯著的物理性能(拉伸強度大)和優(yōu)異的生物學性能(生物相容性和低毒性)作為一種生物醫(yī)學材料而備受關(guān)注[10-11]。

因此，本研究以CS為主體，在CS體系中引入BC來提高復合膜的力學性能。通過超聲破碎的方法將不同比例的CS和BC混合均勻后通過蒸發(fā)自沉積的方式制備出復合膜，將制備出來的復合膜使用氫氧化鈉乙醇溶液浸泡除酸處理后備用。對所制備的各組復合膜在干態(tài)和濕態(tài)下進行拉伸強度的測試，可得在CS ∶BC為10 ∶7時，復合膜的拉伸強度達到最大，分別是(204.7±63.0) MPa (干態(tài))和(44.4±6.4) MPa (濕態(tài))。Bio-Gide膜作為臨床上最常用的GBR膜之一，其在干濕態(tài)下的力學強度分別約為3.7 MPa和1.16 MPa[1]，遠遠低于CS-BC復合膜的力學強度。BC對CS力學性能的增強作用可能取決于以下兩個方面：① BC本身所具有的顯著的拉伸強度[12]；② BC具有高比表面積并且在CS基質(zhì)中分散良好，有利于BC和CS間氫鍵形成[13-14]。取力學強度最大的復合膜組進行后續(xù)生物相容性的實驗，實驗組和空白對照組相比結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義，說明復合膜具備良好的生物相容性。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建CS-BC二元體系的復合膜，探究復合膜的微觀結(jié)構(gòu)，復合膜在干態(tài)和濕態(tài)下的力學性能以及復合膜的細胞相容性。實驗結(jié)果顯示，所制備的新型復合膜在干態(tài)和濕態(tài)下均具有較好的拉伸強度且具有優(yōu)異的生物相容性，有望作為新型的GBR膜而應用于臨床。