紅細(xì)胞CD59分子及其基因單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)聯(lián)性

胡金川，夏建軍，陳松楠，張立敏，田亞平

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種常見的慢性自身免疫性疾病，主要發(fā)生于15～40歲女性，中國SLE患病率為(30.13～70.41)/10萬[1-2]。SLE臨床表現(xiàn)呈多樣性，發(fā)病率雖不高，但具有潛在致命性，嚴(yán)重影響患者特別是育齡女性的生活質(zhì)量。缺乏理想的SLE活動性或治療反應(yīng)標(biāo)志物是有效管理疾病、研發(fā)藥物及發(fā)展新療法的障礙[3]，故尋找用于SLE診斷和病情監(jiān)測的理想標(biāo)志物十分必要。目前已經(jīng)確認(rèn)補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白在免疫紊亂性疾病中的作用和補(bǔ)體抑制劑作為治療藥物的重要性。CD59是18～20 kDa的GPI錨定蛋白，存在于多數(shù)循環(huán)細(xì)胞和組織細(xì)胞膜上，它是4種主要的膜結(jié)合補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白之一，通過結(jié)合C8和(或)C9、干擾C9膜插入及與C5b-8聚合而阻止膜攻擊復(fù)合物C5b-9形成，有效保護(hù)自體細(xì)胞免受補(bǔ)體介導(dǎo)的損害[4-7]。SLE患者CD59分子水平的變化特點(diǎn)及CD59基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)與SLE易感性的關(guān)聯(lián)值得關(guān)注。本研究對SLE患者和健康人群紅細(xì)胞CD59分子水平及CD59基因7個標(biāo)簽SNP位點(diǎn)基因型及等位基因分布特點(diǎn)進(jìn)行研究，以期尋找SLE早期篩查、診斷標(biāo)志物，為SLE發(fā)病機(jī)制和新療法研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集解放軍總醫(yī)院2008年2月—2009年1月診治的119例SLE作為SLE組，其中男17例，女102例；年齡13～74(30.0±15.5)歲；病程0.5～9.0(4.88±2.17)年。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2019年歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟/美國風(fēng)濕病學(xué)會分類標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他自身免疫性疾病、惡性腫瘤者，合并嚴(yán)重細(xì)菌、真菌感染者，妊娠期婦女。另將同一時期來院體檢的健康者117例作為對照組，其中男14例，女103例；年齡17～71(35.0±17.0)歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。將44例SLE和44例健康人納入紅細(xì)胞CD59分子水平與SLE的關(guān)聯(lián)性研究，其中SLE組男4例、女40例，年齡16～60(35.4±11.8)歲；對照組男6例、女38例，年齡19～60(37.4±10.5)歲。2組性別及年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2觀察指標(biāo) 采集受試者清晨空腹靜脈血2 ml至EDTA-K2抗凝管，混勻。采用美國BD公司FACS Calibur流式細(xì)胞儀測定紅細(xì)胞CD59分子水平，異硫氰酸熒光素標(biāo)記鼠IgG2a κ和鼠抗人CD59單克隆抗體試劑購自美國BD Pharmingen公司，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，測試結(jié)果采用相對幾何平均熒光強(qiáng)度(rGMFI)表示，rGMFI=測試管GMFI/同型對照管GMFI。CD59基因標(biāo)簽SNP檢測采用美國Beckman Coulter公司GenomeLabTMSNPstream?基因分型系統(tǒng)及SNPware雜交板及延伸反應(yīng)、雜交反應(yīng)試劑，方法參照文獻(xiàn)[8]，SNP引物序列見表1。

表1 CD59基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)引物序列

2 結(jié)果

2.1紅細(xì)胞CD59分子水平比較 SLE組紅細(xì)胞CD59 rGMFI值為(63.661±18.773)低于對照組的(68.733±19.635)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2基因型、等位基因頻率及患病風(fēng)險分析 經(jīng)檢驗(yàn)，2組7個SNP位點(diǎn)基因型和等位基因頻率均符合HWE(P>0.05)。2組間rs11585和rs12576440基因型頻率、等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，SLE組rs11585 TT基因型及T等位基因、rs12576440 AG基因型及G等位基因頻率高于對照組(P<0.01)，rs11585 CC基因型及C等位基因、rs12576440 AA基因型及A等位基因頻率低于對照組(P<0.01)，其他5個SNP位點(diǎn)各基因型、等位基因組間頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者與健康人基因型、等位基因頻率及患病風(fēng)險分析

3 討論

CD59作為補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，可以阻止自體細(xì)胞免受補(bǔ)體介導(dǎo)的破壞，發(fā)揮補(bǔ)體抑制劑作用。同時，它還參與免疫系統(tǒng)特異細(xì)胞受體信號傳導(dǎo)，或作為其配體參與淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活與增殖，在調(diào)節(jié)抗原遞呈細(xì)胞和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、促炎分子中發(fā)揮重要作用[5]。故CD59分子及基因改變在免疫紊亂性疾病發(fā)生發(fā)展中可能具有非常重要的意義。

CD59廣泛表達(dá)于循環(huán)細(xì)胞表面，在不同細(xì)胞系中表達(dá)差異很大，其中在紅細(xì)胞中表達(dá)最高，而紅細(xì)胞數(shù)量龐大，故CD59分子的免疫作用更值得重視[4-5]。一些研究證實(shí)SLE患者T、B淋巴細(xì)胞表面CD59分子水平顯著降低[9-10]，且CD59水平與SLE疾病活動度有關(guān)[3]。本研究探究SLE患者紅細(xì)胞CD59分子水平變化情況，結(jié)果顯示SLE組紅細(xì)胞CD59 rGMFI值低于對照組。

值得說明的是，雖然流式細(xì)胞術(shù)作為檢測循環(huán)細(xì)胞表面分子的標(biāo)準(zhǔn)方法被廣泛應(yīng)用，但是檢測數(shù)據(jù)分析多采用平均熒光強(qiáng)度(MFI)或GMFI。MFI僅適用于待測分子數(shù)量在細(xì)胞群中呈常數(shù)正態(tài)分布，而GMFI雖不受此限制，但受通道電壓影響。rGMFI則通過反映比對同型對照樣本的相對分子密度，間接反映單個細(xì)胞待測分子數(shù)量。本研究選擇rGMFI分析紅細(xì)胞CD59分子水平，既保證了因單個紅細(xì)胞表面CD59分子數(shù)量不同致細(xì)胞群熒光強(qiáng)度不呈常數(shù)正態(tài)分布時能真實(shí)反映其數(shù)量水平，又克服了在細(xì)胞收集階段通道電壓對結(jié)果的影響，可以保證結(jié)果的可靠性和可比性。本研究SLE組紅細(xì)胞CD59 rGMFI值低于對照組，這與理論推測結(jié)果一致，盡管2組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但因單個紅細(xì)胞CD59分子數(shù)量明顯高于其他循環(huán)細(xì)胞，加之紅細(xì)胞數(shù)量巨大，SLE患者紅細(xì)胞CD59分子總數(shù)減少也十分可觀。紅細(xì)胞CD59分子數(shù)量降低會導(dǎo)致SLE患者體內(nèi)過量的循環(huán)免疫復(fù)合物不能清除、大量趨化因子游離于組織間隙和血漿中及補(bǔ)體介導(dǎo)的紅細(xì)胞溶解增多，致使循環(huán)免疫復(fù)合物沉積、炎性細(xì)胞增殖浸潤及紅細(xì)胞數(shù)量減少，而紅細(xì)胞數(shù)量減少又加劇了免疫分子的下降，形成惡性循環(huán)，可能是SLE發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。

SNP是指染色體上單個核苷酸變異而引起的DNA序列多態(tài)性。SLE是多基因遺傳性疾病，越來越多的研究提示遺傳因子可能影響SLE易感性，現(xiàn)已報道白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-10、IL-19、IL-27、IL-35、IL-23R、CD40、Toll樣受體7等多個免疫分子編碼基因SNP與SLE發(fā)病有關(guān)[11-18]。

CD59作為重要的免疫分子，其編碼基因多態(tài)性與免疫性疾病易感性的關(guān)聯(lián)也受到關(guān)注。一項(xiàng)研究表明，CD59 rs861256 G等位基因與女性落葉型天皰瘡易感性有關(guān)(OR=4.11，P<0.001)，且其攜帶者更易發(fā)展為全身性損害(OR=4.30，P=0.009)、更易于抵抗疾病緩解(OR=3.69，P=0.045)[19]。本研究則發(fā)現(xiàn)，CD59基因rs11585、rs12576440多態(tài)性與SLE易感性有關(guān)，rs11585 TT基因型及T等位基因、rs12576440 AG基因型及G等位基因是SLE發(fā)病的危險因子，rs11585 CC基因型及C等位基因、rs12576440 AA基因型及A等位基因是SLE發(fā)病的保護(hù)因子。在作用機(jī)制上，SNP可以調(diào)控mRNA的觀點(diǎn)已被廣泛接受[20]，不同區(qū)域的SNP作用模式有所不同。

rs11585、rs12576440分別位于3' -非翻譯區(qū)和內(nèi)含子。3' -非翻譯區(qū)含有基因表達(dá)調(diào)控元件，這些元件和調(diào)控因子結(jié)合需要特定的序列組成，這些位點(diǎn)發(fā)生突變，可能導(dǎo)致與調(diào)控因子的結(jié)合能力發(fā)生改變，從而影響正常的基因表達(dá)。內(nèi)含子區(qū)域SNP則主要依靠影響剪切位點(diǎn)活性來調(diào)控基因功能，剪切位點(diǎn)的失活可能會影響基因翻譯功能，影響蛋白質(zhì)序列。可見，SNP可能影響mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)，最終在疾病進(jìn)展中發(fā)揮作用。每個SNP位點(diǎn)可直接參與SLE進(jìn)展或由與其連鎖不平衡的易感性位點(diǎn)引起疾病，多個SNP位點(diǎn)對SLE易感性也可能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)[13]。

綜上，本研究分析了SLE患者紅細(xì)胞CD59分子水平的變化特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)CD59基因SNP位點(diǎn)rs11585、rs12576440與SLE發(fā)病有關(guān)，確定了易感基因型及等位基因，這些指標(biāo)可作為SLE易感性篩查、早期診斷和病情監(jiān)測的標(biāo)志物，也為研究SLE發(fā)生發(fā)展機(jī)制和新治療方法提供了線索。