龐 榕， 李開言， 王聰穎

(1.黃河科技學院醫(yī)學院，河南 鄭州 450005；2.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004)

熊果酸具有抗糖尿病、抗動脈粥樣硬化、調(diào)血脂、降血壓等藥理作用[1-4]，在心血管方面應(yīng)用廣泛。文獻[5]報道，熊果酸lgP為2.17，按照生物藥劑學分類屬于低溶解度、高滲透性物質(zhì)，也是該成分生物利用度低下的主要原因[6]。另外，熊果酸半衰期為3～4 h[6]，整個胃腸道均可被吸收[7]，使得口服給藥后不會在體內(nèi)蓄積[8]。因此，解決熊果酸溶解度差、溶出度低的問題，并將其進一步制成緩控釋制劑有助于充分吸收，提高生物利用度。

單層滲透泵片可使藥物在體內(nèi)外按照恒定速率進行釋藥，相關(guān)性較好[9-10]，其中單層滲透泵片制備工藝簡單，但僅適用于溶解度較高的藥物。本實驗首先制備固體分散體來改善熊果酸溶解度及溶出度，再采用Box-Behnken響應(yīng)面法[11]優(yōu)化其單層滲透泵處方，并考察其體內(nèi)藥動學，以期為相關(guān)制劑開發(fā)提供思路和參考。

1 材料

1.1 儀器 BP210D型電子天平(0.01 mg，瑞士Mettler-Toledo公司)；安捷倫1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；HJ-M4型磁力攪拌水浴鍋(上海赫田科學儀器有限公司)；GIPP-2000型實驗室小型噴霧干燥機(上海繼普電子科技公司)；TDP-1.5型單沖壓片機(廣州德工機械設(shè)備有限公司)；DG-250B型數(shù)顯干燥箱(廣州德工機械設(shè)備有限公司)；ZRS-8型智能溶出試驗儀(天津大學無線電廠)；BYC-1250G型包衣機(鄭州豫鑫設(shè)備有限公司)。

1.2 試劑與藥物 熊果酸原料藥(批號181022，純度98%，南京青澤醫(yī)藥科技有限公司)；熊果酸對照品(批號110888-201503，純度99.8%，中國食品藥品檢定研究院)；氯化鈉(批號AD20160426，陜西盤龍醫(yī)藥物流有限公司)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，批號151015，艾康生物醫(yī)藥有限公司)；乳糖(批號20171015002)、鄰苯二甲酸二丁酯(批號20151115S)(上海輔必成科技有限公司)；聚乙二醇4000(PEG 4000，批號72000050，巴斯夫中國有限公司)；醋酸纖維素(結(jié)合酸54.5%～56.0%，國藥集團化學試劑有限公司)；硬脂酸鎂(批號150617，遼寧奧達制藥有限公司)。

1.3 動物 實驗用健康家兔，雌雄兼具，體質(zhì)量(1.6±0.1)kg，購自河南省動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(豫)2016-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 熊果酸含量測定

2.1.1 色譜條件 ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈-0.2%醋酸(88∶12)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長215 nm；進樣量20 μL。

2.1.2 線性關(guān)系考察 取熊果酸對照品適量，乙腈制成208.00 μg/mL貯備液，流動相制成26.0、10.40、5.20、0.52、0.13 μg/mL對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下各進樣20 μL測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得方程為Y=19.989 2X-1.387 1(r=0.999 8)，在0.13～26.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 供試品溶液制備 取15片單層滲透泵片，研磨成細粉，稱取粉末約0.5 g(約相當于12.5 mg熊果酸)，置于100 mL量瓶中，流動相定容，6 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL至10 mL量瓶中，流動相定容，混勻，即得。

2.1.4 方法學考察 取低(0.13 μg/mL)、中(5.2 μg/mL)、高(26.0 μg/mL)質(zhì)量濃度的對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下各進樣測定6次，測得熊果酸峰面積RSD分別為0.57%、0.36%、0.21%，表明儀器精密度良好。取供試品溶液適量，于0、1、2、4、8、12 h在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得熊果酸峰面積RSD為0.45%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。按“2.1.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得熊果酸含量RSD為1.21%，表明該方法重復性良好。取9份熊果酸含量已知的單層滲透泵片粉末，每份約0.25 g，分別按120%、100%、80%水平加入對照品各3份，置于100 mL量瓶中，流動相定容，6 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL至10 mL量瓶中，流動相定容，混勻，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得熊果酸平均加樣回收率分別為100.15、99.87%、99.14，RSD分別為0.85%、0.62%、1.09%。

2.2 固體分散體制備及溶解度測定 采用噴霧干燥法制備[12]，條件為氮氣體積流量0.5 m3/min；進風溫度100 ℃；泵體積流量5 mL/min；霧化氣體積流量8.5 L/min；噴嘴孔徑0.508 mm。取熊果酸原料藥2.0 g，加入乙醇1 000 mL，超聲處理15 min后抽濾，再加入6.0 g PVP K30攪拌溶解，收集固體粉末，即得，保存于干燥器中。

取過量熊果酸及其固體分散體各3份，置于具塞錐形瓶中，加入適量蒸餾水，固定于恒溫搖床中，設(shè)置溫度為25 ℃，持續(xù)振蕩2 d，8 000 r/min離心10 min，取上清液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。結(jié)果，兩者溶解度分別為(1.77±0.08)、(69.58±0.26)μg/mL。

2.3 單層滲透泵片制備 固定固體分散體用量為50 mg/片，將適量滲透活性劑NaCl、助懸劑CMC-Na與5 mg/片微晶纖維素混勻，補加填充劑至0.5 g/片，加入85%乙醇作為粘合劑，制備片芯軟材，過20目篩，干燥后過20目篩整粒，按1%處方量加入硬脂酸鎂，壓制片芯，硬度為(50±10)N。

丙酮和水按照85∶15的比例制成溶液，再稱取0.4 g鄰苯二甲酸二丁酯、2.0 g醋酸纖維素，溶于100 mL包衣溶劑中，加入0.3 g PEG 4000混勻，即得包衣液。

在包衣鍋溫度、轉(zhuǎn)速、體積流量分別為45 ℃、35 r/min、4 mL/min的條件下對片芯進行包衣，達到預(yù)定片重后，置于45 ℃烘箱中12 h，兩面打孔(直徑0.5～0.8 mm)，即得。

2.4 體外釋放度測定 采用轉(zhuǎn)籃法測定，溶出儀溫度、轉(zhuǎn)速分別為(37±0.5)℃、100 r/min，釋放介質(zhì)為900 mL蒸餾水(實驗開始前均經(jīng)脫氣處理)。將單層滲透泵片投入溶出介質(zhì)后，于0、1、2、4、6、8、10、12 h各取樣3 mL，并補加3 mL同溫度空白釋藥介質(zhì)，6 000 r/min離心10 min，取上清液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算累積釋放度。

2.5 Box-Behnken設(shè)計 單層滲透泵片制備工藝考察、優(yōu)化、驗證均按200片處方量進行，含熊果酸固體分散體50 mg/片。結(jié)合前期單因素試驗結(jié)果，選擇NaCl用量(X1)、CMC-Na用量(X2)、包衣增重(X3)作為影響因素，12 h后累積釋放度(Y)作為評價指標，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素水平

表2 試驗設(shè)計與結(jié)果

采用Design Expert V8.0.6軟件進行響應(yīng)面分析，結(jié)果見圖1。由此可知，固定包衣增重(圖1A)，當NaCl用量較低時CMC-Na用量對累積釋放度基本無影響，當前者逐漸升高時后者影響也逐漸增大，呈現(xiàn)先升后降的趨勢，兩者交互作用有顯著影響；固定CMC-Na用量(圖1B)，隨著NaCl用量和包衣增重增加，累積釋放度先升后降，兩者交互作用有顯著影響；固定NaCl用量(圖1C)，隨著包衣增重和CMC-Na用量增加，累積釋放度呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，兩者交互作用有顯著影響。設(shè)置累積釋放度最大值為100%，最小值為0，得到最優(yōu)處方為NaCl用量62.2 mg/片，CMC-Na用量29.3 mg/片，包衣增重6.1%，12 h后累積釋放度為94.3%。

表3 方差分析

2.6 驗證試驗及模型擬合 按“2.5”項下優(yōu)化處方制備3批單層滲透泵片，進行體外釋放實驗，結(jié)果見圖2，可知三者12 h后累積釋放度分別為93.6%、94.2%、93.7%，平均值為93.8%，與預(yù)測值94.3%接近。模型擬合[13]結(jié)果見表4，可知單層滲透泵片體外釋藥與零級模型擬合度最高，表明藥物以勻速方式緩慢釋放。

表4 單層滲透泵片模型擬合結(jié)果

2.7 體外釋藥研究 熊果酸在0.5%十二烷基硫酸鈉溶液中的溶解度為(49.91±0.35)μg/mL[13]，故其普通片在900 mL該溶液中可達漏槽條件。采用乳糖壓制熊果酸普通片、固體分散體片、單層滲透泵片，含量均為12.5 mg/片，按“2.4”項下方法測定，釋藥介質(zhì)為0.5%十二烷基硫酸鈉溶液(實驗開始前均經(jīng)脫氣處理)，并適當增加取樣點，在同一條件下比較其體外釋藥情況，結(jié)果見圖3。由此可知，普通片最大釋放度為52.3%，固體分散體片1.5 h釋放度即達91.9%，而單層滲透泵片在各個時間點的釋放度逐漸升高，釋藥過程基本呈線性。

2.8 藥動學研究

2.8.1 分析條件 參考文獻[14]報道，ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；流動相0.2%醋酸-乙腈(20∶80)；體積流量0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量5 μL；電噴霧離子源，負離子模式掃描；氣體溫度350 ℃；壓力30 psi(1 psi=6.895 kPa)；m/z100～1 000，選擇m/z469.3(甘草次酸)、m/z455.3(熊果酸)進行分析。

2.8.2 分組、給藥與血漿處理 將18只家兔隨機分為3組并編號，兔耳去毛，實驗前禁食12 h不禁水，取熊果酸普通片、固體分散體片、單層滲透泵片各2片，用開口器送入口中，溫水送服，于0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、12、18 h固定于木盒中，僅漏出頭部，取適量二甲苯涂抹于耳緣，靜脈處取血約1 mL，置于肝素化離心管中，混勻，3 000 r/min離心6 min，取血漿低溫冷凍保存。

血漿常溫解凍后吸取0.25 mL，與0.1 mL內(nèi)標(甘草次酸)溶液一同置于離心管中，加入5 mL乙酸乙酯，渦旋混勻提取15 min，8 000 r/min離心5 min，取上層有機相，氮氣吹干得殘渣，加入0.25 mL乙腈復溶。

2.8.3 血漿對照品溶液制備及線性關(guān)系考察 乙腈制成200 ng/mL內(nèi)標溶液、2 000 ng/mL對照品溶液，并將后者稀釋至1 000、500、100、50、25 ng/mL，分別取0.25 mL，氮氣吹干后加入0.25 mL空白血漿，即得血漿對照品溶液。按“2.8.2”項下方法處理，在“2.8.1”項條件下進樣測定，以熊果酸與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標(Y)，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(X)進行回歸，得方程為Y=1.521 8C+9.354 1(r=0.991 4)，在25～2 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.8.4 方法學考察 取血漿1份，于0、3、6、9、12、24 h在“2.8.1”項條件下進樣測定6次，測得熊果酸與內(nèi)標峰面積比值RSD為6.13%，表明血漿在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。取50、500、2 000 ng/mL血漿對照品溶液，在“2.8.1”項條件下各進樣測定6次，測得熊果酸與內(nèi)標峰面積比值RSD分別為11.44%、9.69%、7.34%，表明儀器精密度良好。取上述3種質(zhì)量濃度熊果酸溶液，按“2.8.2”項下方法處理，在“2.8.1”項條件下進樣測定，計算峰面積ρ1；取空白血漿0.25 mL，不加內(nèi)標，按“2.8.2”項下方法處理，加入內(nèi)標溶液和50、500、2 000 ng/mL對照品溶液各0.25 mL，在“2.8.1”項條件下進樣測定，計算峰面積ρ2；取50、500、2 000 ng/mL對照品溶液，在“2.8.1”項條件下進樣測定，計算峰面積ρ3，各平行3次，按公式(ρ2/ρ3)×100%考察基質(zhì)效應(yīng)，(ρ1/ρ2)×100%考察提取回收率。結(jié)果，熊果酸提取回收率分別為90.24%、88.31%、93.14%，RSD分別為8.14%、7.39%、5.96%；內(nèi)標提取回收率為90.99%，RSD為7.80%；熊果酸基質(zhì)效應(yīng)分別為91.05%、96.17%、95.63%，RSD分別為6.69%、5.92%、8.23%；內(nèi)標基質(zhì)效應(yīng)為95.73%，RSD為6.34%。

2.8.5 結(jié)果分析 圖4、表5顯示，與普通片比較，固體分散體片tmax縮短(P<0.05)，Cmax升高(P<0.01)，血藥濃度波動幅度較大，相對生物利用度提高至2.79倍；與普通片、固體分散體片比較，單層滲透泵片tmax、t1/2延長(P<0.01)，Cmax波動較小，相對生物利用度提高至2.84倍，但AUC0～t、AUC0～∞與固體分散體片比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表5 熊果酸主要藥動學參數(shù)

3 討論

由于熊果酸溶解度較差，其單層滲透泵片片芯環(huán)境滲透壓較低，可能會導致釋藥動力不足，最終影響片劑累積釋放度，而雙層滲透泵制劑不僅制備工藝復雜，還需識別含藥層并進行打孔，對設(shè)備要求較高[15]。本實驗將熊果酸制成固體分散體后，有助于提高該成分溶解度及其單層滲透泵片芯環(huán)境的滲透壓[16]。

課題組前期考察了淀粉、乳糖、蔗糖作為填充劑時對單層滲透泵片的影響，考慮到可壓性、流動性、累積釋放度，最終選擇乳糖。再分別對NaCl用量(50、60、70 mg/片)、CMC-Na用量(15、20、25、30 mg/片)、包衣增重(4%、6%、8%)進行考察，最終確定三者分別為55～65 mg/片、20～30 mg/片、5%～7%。

文獻[17-18]報道，固體分散體在增加藥物溶解度、提高溶出速率的同時，也會加大血藥濃度波動幅度，進而可能產(chǎn)生不良反應(yīng)，造成藥效不穩(wěn)。本實驗將熊果酸固體分散體制成控釋片后，由于其快速釋藥得到有效控制，有助于平穩(wěn)血藥濃度，降低潛在不良反應(yīng)。藥動學研究顯示，熊果酸制成固體分散體后，其相對生物利用度提高至2.79倍，但Cmax提高至4.70倍，波動幅度較大；單層滲透泵片可抑制固體分散體Cmax波動，緩釋特征明顯，有助于增加制劑安全性，并且口服吸收生物利用度提高至2.84倍，一方面可能與固體分散體提高熊果酸溶解度、溶出度有關(guān)；另一方面緩釋制劑使藥物在胃腸道滯留時間延長，有助于其充分吸收。