劉子歌， 張 晨， 宋國(guó)瑞， 李 燕， 郭鳳英， 劉心蕊， 陳德勝

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室寧夏生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；4.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院骨科，寧夏 銀川 750004)

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療終末期關(guān)節(jié)疾病最成功的手術(shù)之一。然而，假體周圍骨溶解和隨后出現(xiàn)的無(wú)菌性松動(dòng)是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)失敗的主要原因[1]。目前，翻修手術(shù)是治療無(wú)菌性松動(dòng)的唯一有效方法。近年來(lái)，與無(wú)菌性松動(dòng)相關(guān)的研究主要集中在藥物于分子水平上調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向成熟破骨細(xì)胞分化和炎癥反應(yīng)的機(jī)制[2]。假體周圍骨溶解的發(fā)病機(jī)制涉及促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生、破骨細(xì)胞的激活和磨粒刺激后的骨丟失。核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號(hào)通路是磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解的潛在重要治療靶點(diǎn)之一[3]。

姜黃素是從姜黃的根中分離出來(lái)的一種生物相容性較好的多酚化合物。研究發(fā)現(xiàn)，它可以防止卵巢切除術(shù)引起的骨質(zhì)流失并增強(qiáng)骨骼[4]。姜黃素可能通過(guò)抑制促炎性介質(zhì)腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)來(lái)減輕炎癥反應(yīng)，并通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答[5]?；诖?，姜黃素被認(rèn)為是預(yù)防假體周圍骨溶解和人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)的潛在候選藥物。然而，在顆粒誘導(dǎo)的骨溶解過(guò)程中，姜黃素的抗骨吸收能力是否與RANKL/骨保護(hù)素(OPG)信號(hào)系統(tǒng)相關(guān)也尚不清楚。本研究采用小鼠氣囊植骨模型，研究姜黃素對(duì)鈦顆粒誘導(dǎo)的骨溶解作用的影響及其相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1 材料

1.1 動(dòng)物 8～10周齡雌性SPF級(jí)BALB/c小鼠，體質(zhì)量(22±3)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SYXK(京)2015-0027，飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查編號(hào)2015-019。

1.2 試劑與藥物 姜黃素(美國(guó)MCE公司，純度96.31%，批號(hào)09276)。納米級(jí)鈦顆粒(美國(guó)Alfa Aesar公司，批號(hào)7440-32-6)；內(nèi)毒素檢測(cè)鱟試劑盒(廈門鱟試劑生物科技股份有限公司，貨號(hào)EC80545)；血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酐(Cre)、尿素氮(BUN)診斷試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)C00921、C01021、C01121、C01321)；TNF-α、IL-1β、IL-6、OPG、RANKL ELISA試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)bsk12002、bsk12015、bsk12004、bsk11028、bsk12048)；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒、DMSO、實(shí)驗(yàn)用玉米油(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)CS0740、D2650、C8267)；Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司，貨號(hào)RR014A、638315)。

1.3 儀器 EG1150型組織包埋機(jī)、RM2265型全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)等病理設(shè)備(德國(guó)Leica公司)；H-7650型透射電子顯微鏡(日本日立公司)；IX71型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 姜黃素、鈦顆粒的制備 采用5% DMSO將姜黃素配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液，玉米油定容至25 mg/kg，現(xiàn)配現(xiàn)用。通過(guò)投射電子顯微鏡觀察納米級(jí)鈦顆粒，確定99%的顆粒直徑小于10 μm(圖1)，用70%乙醇浸泡滅菌48 h，無(wú)菌磷酸鹽緩沖鹽(PBS)洗滌3次，去除顆粒中附著的內(nèi)毒素，嚴(yán)格按照內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為小于0.05 EU/mL，確認(rèn)用于實(shí)驗(yàn)的鈦顆粒中無(wú)內(nèi)毒素，將鈦顆粒懸浮在質(zhì)量濃度為1 mg/mL的無(wú)菌PBS中備用。

2.2 建模、分組與給藥 參考文獻(xiàn)[6-7]報(bào)道，建立小鼠氣囊植骨模型。麻醉小鼠后在其背部注射2 mL無(wú)菌空氣形成氣囊，每天向氣囊中注射0.5 mL無(wú)菌空氣，連續(xù)6 d，第7天氣囊形成；另選小鼠處死，取出其顱骨骨片，剔除多余的軟組織。切開(kāi)氣囊，植入小鼠顱骨骨片，縫合切口。將30只小鼠隨機(jī)分為空白組(PBS)、模型組(PBS混懸鈦顆粒)、姜黃素組(25 mg/kg姜黃素混懸鈦顆粒)，每組10只。造模成功后第2天，模型組和姜黃素組小鼠氣囊注射0.1 mg/mL 鈦顆粒懸浮液0.1 mL，空白組小鼠氣囊注射等體積PBS；姜黃素組小鼠腹腔注射25 mg/kg姜黃素，空白組和模型組小鼠腹腔注射等體積PBS，每天1次，連續(xù)14 d。14 d后將小鼠脫頸處死，收集具有完整顱骨植入物及氣囊組織，用于后續(xù)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)分析。

2.3 小鼠組織學(xué)形態(tài)觀察 將收集好的組織進(jìn)行蠟塊包埋，切成5 μm薄片，對(duì)植入小鼠顱骨骨片進(jìn)行HE和TRAP染色，顯微鏡檢查染色切片的圖像，并截取有代表性的圖片。參考文獻(xiàn)[8]報(bào)道，光鏡下確定氣囊的厚度和植入骨片被腐蝕的面積，研究骨吸收程度，骨吸收處附近紫色顆粒的數(shù)量為TRAP陽(yáng)性細(xì)胞。將收集到的組織用2%戊二醛和1%鋨酸先后固定，石蠟包埋切片后，收集到鍍有Fomvar膜的銅網(wǎng)上，5%乙酸鈾酰染色4 min，檸檬酸鉛染色2 min，在透射電子顯微鏡下觀察切片，所有切片采用雙盲法由2位實(shí)驗(yàn)員獨(dú)立閱片，并進(jìn)行最終結(jié)果評(píng)定。

2.4 RT-qPCR法檢測(cè)小鼠顱骨組織中TRAP、NFATc1、OPG、RANKLmRNA表達(dá) 取小鼠氣囊組織70 mg，使用TRIzol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄酶和cDNA合成試劑盒合成cDNA，使用SYBR GREEN試劑盒，提取1 μL cDNA進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，檢測(cè)各組小鼠顱骨組織中TRAP、NFATc1、OPG、RANKLmRNA表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參基因，計(jì)算各目的基因相對(duì)表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.5 ELISA法檢測(cè)小鼠植入顱骨組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、OPG、RANKL水平 在無(wú)菌條件下解剖并收集小鼠植入顱骨(每組3只)，在37 ℃、5% CO2下，用含1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，800 r/min離心5 min，收集培養(yǎng)液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠植入顱骨培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6、OPG、RANKL水平。

2.6 小鼠肝腎功能檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)采集各組小鼠血液，3 000 r/min離心15 min，得上層血清，采用診斷試劑盒檢測(cè)血清中ALT、AST、Cre、BUN活性。

3 結(jié)果

3.1 姜黃素對(duì)小鼠鈦顆粒誘導(dǎo)的骨溶解的影響 模型組小鼠破骨細(xì)胞膜皺褶似偽足狀，細(xì)胞核擴(kuò)大，細(xì)胞質(zhì)豐富，其中含有大量粗糙的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核線粒體，溶酶體數(shù)量增加，在骨組織表面可以觀察到溶骨性變化；姜黃素組小鼠由鈦顆粒引起的骨丟失減少，破骨細(xì)胞質(zhì)內(nèi)溶體核線粒體的數(shù)量減少，破骨活躍程度降低。與空白組比較，模型組小鼠植入顱骨的氣囊袋組織增厚，氣囊袋組織中觀察到大量的巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞，炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈，且在骨膜界面區(qū)域有糜爛點(diǎn)；與模型組比較，姜黃素組小鼠顱骨植入袋的厚度減少(P<0.01)，見(jiàn)圖2，提示姜黃素在體內(nèi)對(duì)磨損顆粒誘導(dǎo)的骨吸收具有保護(hù)作用。

3.2 姜黃素對(duì)小鼠鈦顆粒誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成的影響 模型組小鼠顱骨組織破壞嚴(yán)重，在侵蝕坑處可見(jiàn)緊密排列的紫色顆粒，見(jiàn)圖3A。每1個(gè)高倍鏡視野下，模型組小鼠顱骨組織TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為(78.17±9.72)個(gè)；與模型組比較，姜黃素組小鼠顱骨組織TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.01)，為(43.33±5.22)個(gè)，見(jiàn)圖3B。

3.3 姜黃素對(duì)小鼠破骨細(xì)胞中TRAP、NFATc1、OPG、RANKLmRNA表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組小鼠破骨細(xì)胞中TRAP、NFATc1、RANKLmRNA表達(dá)升高(P<0.01)，OPGmRNA表達(dá)降低(P<0.01)；與模型組比較，姜黃素組小鼠破骨細(xì)胞中TRAP、NFATc1、RANKLmRNA表達(dá)降低(P<0.01)，OPGmRNA表達(dá)升高(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

3.4 姜黃素對(duì)小鼠植入顱骨中TNF-α、IL-1β、IL-6、RANKL水平的影響 與空白組比較，對(duì)照組小鼠植入顱骨中鈦顆粒OPG水平降低(P<0.01)，TNF-α、IL-1β、IL-6、RANKL水平及RANKL/OPG比值升高(P<0.01)；與模型組比較，姜黃素組小鼠植入顱骨中鈦顆粒OPG水平升高(P<0.01)，TNF-α、IL-1β、IL-6、RANKL水平及RANKL/OPG比值降低(P<0.01)，見(jiàn)圖5，提示姜黃素可以逆轉(zhuǎn)鈦顆粒刺激后RANKL/OPG比值的失衡。

3.5 各組小鼠肝腎功能檢測(cè) 與空白組比較，姜黃素組小鼠血清中ALT、AST、Cre、BUN活性無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠肝腎功能水平

4 討論

姜黃素是從香料姜黃中提取的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗感染等作用[9-11]。人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)由假體來(lái)源的磨損顆粒的激活、巨噬細(xì)胞的募集和破骨細(xì)胞局部炎癥反應(yīng)啟動(dòng)，從而導(dǎo)致骨吸收[12]。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化來(lái)抑制鈦顆粒引起的炎癥[13-14]?；罨钠乒羌?xì)胞對(duì)于骨吸收至關(guān)重要[15]。因此，研究姜黃素減輕磨粒誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成的效果與機(jī)制對(duì)治療骨溶解性疾病具有重要意義。本研究證實(shí)在鈦顆粒的刺激下會(huì)導(dǎo)致骨丟失，并且在小鼠顱骨組織中檢測(cè)出破骨細(xì)胞，在姜黃素的干預(yù)下能有效降低TRAP陽(yáng)性破骨細(xì)胞。提示，姜黃素在預(yù)防與破骨細(xì)胞相關(guān)的磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解方面起到積極作用。

RANKL對(duì)破骨細(xì)胞的激活、分化和成熟有十分重要的功能，而OPG是RANKL的天然拮抗受體，可以下調(diào)破骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)和破骨細(xì)胞生成。研究表明，患者滑膜或關(guān)節(jié)滑液中RANKL和OPG表達(dá)的比值對(duì)假體周圍骨溶解的發(fā)生至關(guān)重要[16-17]。本研究認(rèn)為，姜黃素是通過(guò)抑制RANKL/RANK信號(hào)通路，從而抑制破骨細(xì)胞的形成和治療磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解。磨損顆粒的吞噬作用引起炎癥反應(yīng)和促炎細(xì)胞因子的釋放，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞活化和隨后的骨吸收[18]。此外，姜黃素對(duì)膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎也具有抗炎活性[19]。本研究證實(shí)，姜黃素可以抑制界面膜上的主要細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的產(chǎn)生。因此，本研究認(rèn)為姜黃素對(duì)促炎細(xì)胞因子的抑制作用有可能減輕磨損顆粒引起的慢性炎癥。

Hussan等[20]發(fā)現(xiàn)，高劑量姜黃素通過(guò)增加成骨細(xì)胞數(shù)對(duì)去卵巢大鼠骨丟失起到保護(hù)作用，與本研究對(duì)姜黃素的骨保護(hù)效應(yīng)結(jié)果一致。然而，在Hussan的研究中，姜黃素被給予2個(gè)月的灌胃治療，而在本研究中，姜黃素只被腹腔注射了2周。因此，需要進(jìn)一步的研究來(lái)探索給藥劑量、給藥時(shí)間和給藥途徑。

綜上所述，姜黃素可通過(guò)抑制RANKL信號(hào)通路來(lái)減輕鈦顆粒誘導(dǎo)的小鼠氣囊植骨模型的炎癥骨溶解，可能成為防治人工關(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)的候選化合物。