吳玉蓮， 李昕倡， 李 明， 孫 雪， 羅雨淵， 趙佳儀， 李 巖*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

動(dòng)脈粥樣硬化是嚴(yán)重影響健康的常見疾病，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)在其中扮演著重要角色，衣原體、氧化低密度脂蛋白等通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、PI3K/Akt、NF-κB等信號(hào)通路，促使中膜VSMCs增殖、肥大，最終導(dǎo)致病情發(fā)生[1-2]。研究表明，抑制VSMCs增殖和遷移可有效減緩動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，這不僅證實(shí)了它在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的重要作用，也為相關(guān)治療提供了靶點(diǎn)[3-4]。目前發(fā)現(xiàn)，益氣固本湯、白藜蘆醇、紅景天等多種中藥復(fù)方或單體都具有抗VSMCs增殖和遷移作用[5-7]。

PM2.5作為新發(fā)現(xiàn)的動(dòng)脈粥樣硬化致病因素，它與該病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系已經(jīng)得到確認(rèn)[8]。課題組前期發(fā)現(xiàn)PM2.5不僅可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，還能促進(jìn)VSMCs的增殖和遷移，并且MAPKs家族中的p38 MAPK和JNK參與該過程[9-10]，但中藥對(duì)PM2.5誘導(dǎo)的VSMCs增殖和遷移的影響尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)建立PM2.5染毒的VSMCs模型，采用白藜蘆醇進(jìn)行干預(yù)，觀察該成分對(duì)VSMCs增殖和遷移的影響，并探討其作用機(jī)制，以期尋找防治PM2.5心血管毒性的新方法。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 VSMCs購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司，用含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑 白藜蘆醇(純度≥99%，貨號(hào)R5010-100MG, 美國Sigma-Aldrich公司)，參考Gueguen等[11]報(bào)道的方法，用DMSO配制成40 mmol/L貯存液，置于-20 ℃冰箱中避光保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)取適量加入完全培養(yǎng)基中稀釋至所需終濃度。PM2.5(貨號(hào)SRM1649b，美國Sigma-Aldrich公司)，用培養(yǎng)基配制為50 mg/mL貯存液，置于-20 ℃冰箱中保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)先混勻，再取適量加入完全培養(yǎng)基中稀釋至所需終濃度。CCK-8試劑盒(貨號(hào)JE603)購自日本同仁化學(xué)研究所；MAPK抗體(貨號(hào)A10832)、Phospho-p38 MAPK抗體(貨號(hào)AP0297)、JNK抗體(貨號(hào)9258T)、Phospho-JNK抗體(貨號(hào)4668S)、GAPDH抗體(貨號(hào)AC033)、HRP標(biāo)記的二抗均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；RIPA細(xì)胞裂解液(貨號(hào)P0013B)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號(hào)P0012S)、ECL顯色試劑盒(貨號(hào)P0018S)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 MCO-175型CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)；H1850R型高速冷凍離心機(jī)(湖南長沙湘儀檢測設(shè)備有限公司)；680型酶標(biāo)儀、1645050型電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Tanon 5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；MS800共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 分組及給藥 將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、PM2.5組、白藜蘆醇組，其中PM2.5組根據(jù)課題組前期報(bào)道，終質(zhì)量濃度采用12.5 μg/mL PM2.5染毒[9]；白藜蘆醇組先用不同終濃度(5、10、20 μmol/L)白藜蘆醇預(yù)處理24 h，再用12.5 μg/mL PM2.5染毒；對(duì)照組、PM2.5組培養(yǎng)基中分別含有與白藜蘆醇組(20 μmol/L)相同濃度的DMSO，以排除溶劑可能造成的影響。根據(jù)檢測要求，在染毒后不同時(shí)間收集樣品進(jìn)行后續(xù)操作。

2.2 CCK-8法檢測VSMCs增殖率 取100 μL細(xì)胞懸液(含5×103個(gè)細(xì)胞)接種于96孔板內(nèi)，按“2.1”項(xiàng)下方法分組及給藥，每組6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白孔調(diào)零。培養(yǎng)24 h后，每孔加入CCK-8溶液100 μL，孵育4 h后用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

2.3 EdU法檢測VSMCs增殖能力 取1 mL細(xì)胞懸液(含1×105個(gè)細(xì)胞)接種于24孔板內(nèi)預(yù)置的載玻片上，待細(xì)胞貼壁后按“2.1”項(xiàng)下方法分組及給藥，每組3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，更換為含50 μmol/L EdU的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育3 h，再按說明書進(jìn)行固定和染色，最后用Hoechst 33342標(biāo)記細(xì)胞。在共聚焦顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行采樣，計(jì)算EdU染色陽性細(xì)胞率。

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察VSMCs遷移能力 取1 mL細(xì)胞懸液(含5×105個(gè)細(xì)胞)接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后用100 μL槍頭垂直在培養(yǎng)板中劃線，PBS清洗脫落的細(xì)胞，按“2.1”項(xiàng)下方法分組及給藥，每組3個(gè)復(fù)孔。于染毒0、24 h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察并拍照，測量劃痕面積，計(jì)算劃痕愈合率。

2.5 Transwell法檢測VSMCs遷移能力 取200 μL細(xì)胞懸液(含1×104個(gè)細(xì)胞)加入Transwell小室上室，下室加入含15% FBS的DMEM培養(yǎng)基500 μL，按“2.1”項(xiàng)下方法分組及給藥，每組3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后取出上室，PBS清洗3次，多聚甲醛固定20 min，風(fēng)干后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，以實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)的比值代表細(xì)胞遷移能力。

2.6 Western blot法檢測p38 MAPK和JNK蛋白磷酸化表達(dá) 取1 mL細(xì)胞懸液(含5×105個(gè)細(xì)胞)接種于6孔板內(nèi)，貼壁后按“2.1”項(xiàng)下方法分組及給藥，每組3個(gè)復(fù)孔。根據(jù)課題組前期結(jié)果，在染毒20 min后收集細(xì)胞，RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度[9]。取15 μg變性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，常規(guī)轉(zhuǎn)膜，BSA封閉，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜后TBST洗滌3次，再用二抗(1∶5 000)孵育2 h，最后加入ECL發(fā)光液曝光、拍照。采用Image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算磷酸化蛋白與總蛋白的比值。

3 結(jié)果

3.1 白藜蘆醇對(duì)PM2.5誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞增殖的影響 圖1A顯示，與對(duì)照組比較，PM2.5組可促進(jìn)VSMCs增殖(P<0.05)；與PM2.5組比較，不同濃度白藜蘆醇組均可抑制PM2.5誘導(dǎo)的VSMCs增殖(P<0.05)。圖1B～1C顯示，與PM2.5組比較，白藜蘆醇組EdU染色陽性細(xì)胞數(shù)目減少，比例降低(P<0.05)，白藜蘆醇濃度為20 μmol/L時(shí)抑制效果最強(qiáng)。

3.2 白藜蘆醇對(duì)PM2.5誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞遷移的影響 圖2A顯示，與對(duì)照組比較，PM2.5組細(xì)胞劃痕愈合率升高(P<0.05)；與PM2.5組比較，白藜蘆醇組細(xì)胞劃痕愈合率降低(P<0.05)。圖2B顯示，與對(duì)照組比較，PM2.5組穿膜細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)；與PM2.5組比較，白藜蘆醇組穿膜細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)。

3.3 白藜蘆醇對(duì)PM2.5誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞p38 MAPK、JNK蛋白磷酸化表達(dá)的影響 圖3顯示，與對(duì)照組比較，PM2.5組細(xì)胞p38 MAPK、JNK蛋白磷酸化表達(dá)升高(P<0.05)；與PM2.5組比較，白藜蘆醇組細(xì)胞p38 MAPK、JNK蛋白磷酸化表達(dá)降低(P<0.05)。

4 討論

VSMCs主要存在于血管壁中膜,生理狀態(tài)下其增殖和凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡,病理情況下其發(fā)生增殖、肥大并向內(nèi)皮下遷移,同時(shí)分泌細(xì)胞外基質(zhì)，參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成[1]。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)VSMCs來源的細(xì)胞占70%左右，因此VSMCs的增殖和遷移在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病中占重要地位[12]。多種動(dòng)脈粥樣硬化致病因子均可影響VSMCs，本實(shí)驗(yàn)室和其他研究者都證實(shí)大氣污染物中的PM2.5致動(dòng)脈粥樣硬化作用也與影響VSMCs的增殖和遷移有關(guān)，并認(rèn)為p38 MAPK和JNK途徑參加介導(dǎo)了該過程[9-10,13]。

中藥具有多靶點(diǎn)、多層次等優(yōu)勢，在干預(yù)VSMCs方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，多種中藥復(fù)方或有效成分被證實(shí)具有抗VSMCs增殖和遷移作用[14-15]。研究顯示白藜蘆醇可通過影響氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多種途徑，抑制Ox-LDL、血管緊張素Ⅱ等動(dòng)脈粥樣硬化致病因子誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞增殖和遷移[7,15-17]。然而白藜蘆醇對(duì)PM2.5染毒VSMCs細(xì)胞的影響并不清楚。本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇干預(yù)后VSMCs細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞遷移能力均下降，表明白藜蘆醇可抑制PM2.5誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞增殖和遷移。

p38 MAPK和JNK均屬于MAPKs家族成員，是多種細(xì)胞增殖、分化、凋亡的重要調(diào)節(jié)通路[18-19]。以往研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5染毒會(huì)使VSMCs細(xì)胞的p38 MAPK和JNK蛋白磷酸化表達(dá)升高，并且相應(yīng)的抑制劑可以抑制VSMCs細(xì)胞增殖和遷移，證明p38 MAPK和JNK參與介導(dǎo)PM2.5對(duì)VSMCs的毒性[9]。本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇干預(yù)后細(xì)胞p38 MAPK和JNK蛋白磷酸化表達(dá)降低，提示白藜蘆醇的作用效果與抑制二者磷酸化表達(dá)有關(guān)。其他研究者發(fā)現(xiàn)大蒜素、川穹嗪等中藥有效成分也可以通過影響p38 MAPK等MAPKs家族蛋白來抑制PM2.5引起的VSMCs增殖[10]。

綜上所述，白藜蘆醇可能通過降低p38 MAPK和JNK磷酸化表達(dá)來抑制PM2.5誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，有望為進(jìn)一步利用白藜蘆醇防治PM2.5誘導(dǎo)的心血管毒性提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。