谷仿麗， 黃仁術， 何曉梅， 姜雪萍， 陳乃富， 韓邦興， 鄧 輝

(皖西學院生物與制藥工程學院，安徽省中藥資源保護與持續(xù)利用工程實驗室，安徽 六安 237012)

慢性傳輸型便秘是功能性便秘中的一種類型，以結腸運行緩慢，水分吸收增加致大便干硬，排便次數(shù)減少，無便意并伴有腹脹腹痛的一種疾病[1]，臨床上藥物治療遠期效果不佳，停藥后容易復發(fā)[2]。目前慢性傳輸型便秘發(fā)病機制尚不明確，近年來的研究認為其與腸道菌群失調及腸道水通道蛋白(aquaporin，AQPs)表達異常有關[3]。

蘘荷Zingibermioga(Thunb.) Rosc.又名陽荷、野姜、觀音花等，具有祛痰止咳、解毒消腫、活血調經(jīng)等功效，臨床用于治療咳嗽、腹痛腹脹、月經(jīng)不調等病癥。蘘荷含有蛋白質、脂肪、膳食纖維、微量元素及人體必需氨基酸等多種營養(yǎng)素及黃酮、多糖等成分[4]。前期進行蘘荷黃酮、多糖、色素的提取工藝及生物活性研究[5-9]，并進行蘘荷水提物對慢性傳輸型便秘小鼠腸運動的影響研究，發(fā)現(xiàn)蘘荷水提物可增加便秘小鼠首次排便時間、排便量，促進腸蠕動，但其作用機制及有效部位尚不明確。本實驗基于腸道菌群及AQP3表達，初步篩選蘘荷治療慢傳輸型便秘的有效部位。

1 材料

1.1 動物 昆明種小鼠，體質量18～22 g，購于安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(皖)2017-001。

1.2 試劑與藥物 蘘荷，采于皖西大別山區(qū)，經(jīng)黃仁術教授鑒定為蘘荷Zingibermioga(Thunb.)Rosc.。鹽酸洛哌丁胺膠囊(西安楊森制藥有限公司，批號191025433)；大黃通便顆粒(甘肅扶正藥業(yè)科技股份有限公司，批號19052703)。RIPA裂解液(批號2002041)、磷酸化蛋白酶抑制劑(批號2007082)、5×蛋白還原型上樣緩沖液(批號2003023)、HRP山羊抗兔抗體(批號2003304)(武漢賽維爾生物科技有限公司)；D3141糞便DNA試劑盒(廣州美基生物科技有限公司，批號20092708)。

1.3 儀器 灰度分析軟件(美國Alpha Innotech公司)；瓊脂糖凝膠電泳儀(北京六一儀器廠)；凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；PCR 儀(蘇州東勝興業(yè)科學儀器有限公司)；Qubit 3.0熒光定量儀(美國Thermo Fischer公司)。

2 方法

2.1 蘘荷提取物的制備 取1 kg新鮮蘘荷，干燥，粉碎，過40目篩，繼續(xù)干燥至恒重。取適量蘘荷粉末，以料液比1∶25、溫度90 ℃提取2次，每次1.5 h，合并濾液，減壓濃縮至提取物相對密度1.13，取出部分提取物，即得蘘荷水提物，繼續(xù)濃縮至膏狀，冷凍干燥；剩余蘘荷水提物緩慢加入4倍量95%乙醇，邊加邊攪拌至均勻，保鮮膜封口，4 ℃冰箱保存24 h，4 000 r/min離心10 min，取沉淀物冷凍干燥，即得蘘荷醇沉部位；醇溶部位減壓濃縮至膏狀，冷凍干燥，即得蘘荷醇溶部位；將干燥物粉碎，過100目篩，即得蘘荷水提物、醇沉部位、醇溶部位干粉。

2.2 蘘荷不同提取物對慢性傳輸型便秘小鼠排便的影響 選取健康小鼠60只，隨機分為正常組、模型組、大黃通便顆粒組和蘘荷水提物、醇溶物、醇沉物組，每組10只。正常組及模型組灌胃0.5% CMC-Na溶液，給藥組分別灌胃給予蘘荷水提物、醇溶物、醇沉物0.5 g/kg和大黃通便顆粒3 g/kg，連續(xù)14 d。末次給藥前各組小鼠禁食不禁水16 h，末次給藥后1 h，給藥組及模型組灌胃鹽酸洛哌丁胺4 mg/kg復制便秘模型，正常組灌胃等容量蒸餾水，30 min后，每只小鼠灌胃5%活性炭溶液0.1 mL。記錄每只小鼠首次排出黑便時間以及8 h內排出黑便的總粒數(shù)及總重量。

2.3 蘘荷不同提取物對慢性傳輸型便秘小鼠小腸推進率及AQP3表達的影響 選取健康小鼠60只，按“2.2”項下方法進行分組、給藥及造模，15 min后脫頸椎處死，取小腸，測量小腸全長及碳末推進距離，計算各組小腸推進率。取升結腸并剖開，用預冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌以去除血污，剪成小塊置于勻漿管中進行勻漿；取出勻漿液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，即為總蛋白溶液，Western blot法檢測結腸AQP3表達[10]。

2.4 蘘荷不同提取物對慢性傳輸型便秘小鼠腸道菌群的影響 選取健康小鼠60只，按“2.2”項下方法進行分組、給藥及造模，30 min后，取小鼠糞便，立即液氮保存?zhèn)溆谩Ｈ⌒∈蠹S便解凍，根據(jù)試劑盒說明書，提取糞便DNA，NanoDrop微量分光光度計檢測DNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢驗核酸樣本的完整性。以稀釋后的DNA為模板，選用細菌16S rRNA (V3-V4)區(qū)域引物，進行 PCR 純化和擴增，341 bp正向序列5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′，806 bp反向序列5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′。使用AMPure XP Beads對第2輪擴增產(chǎn)物進行純化，用ABI StepOnePlus Real Time PCR 系統(tǒng)進行定量，根據(jù)Novaseq 6000的PE250模式pooling上機測序。

3 結果

3.1 蘘荷不同提取物對慢性傳輸型便秘小鼠排便的影響 與正常組比較，模型組小鼠首次排便時間延長(P<0.01)，排便粒數(shù)及重量減少(P<0.01)；與模型組比較，蘘荷各提取物組首次排便時間均縮短(P<0.01)，排便粒數(shù)及重量均增加(P<0.05，P<0.01)，表明相同劑量的蘘荷不同提取物均有促進便秘小鼠胃腸運動的作用，以水提物作用最佳。結果見表1。

表1 蘘荷不同提取物對慢性傳輸型便秘小鼠排便的影響

3.2 蘘荷不同提取物對慢性傳輸型便秘小鼠小腸推進率的影響 與正常組比較，模型組小鼠小腸推進率降低(P<0.01)；與模型組比較，蘘荷各提取物組小腸推進率升高(P<0.05，P<0.01)，表明蘘荷各提取物均具有推動便秘小鼠小腸運動的作用，各提取物組間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結果見圖1。

3.3 蘘荷不同提取物對慢性傳輸型便秘小鼠結腸AQP3表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠AQP3表達提高(P<0.05)，表明模型小鼠結腸水分吸收增加；與模型組比較，蘘荷水提物、醇沉物組和大黃通便顆粒組AQP3表達均降低(P<0.05)，表明蘘荷水提物、醇沉物均有降低模型小鼠升結腸水分吸收，改善大便干燥癥狀。結果見圖2。

3.4 蘘荷不同提取物對慢性傳輸型便秘小鼠腸道菌群的影響

3.4.1 對腸道菌群物種組成的影響 各組均選取在門、綱、目、科、屬、種水平上OTU排名前10的物種進行比較，繪制以門水平的物種為例的相對豐度堆積柱形圖(圖3)。在門水平上，各組均以擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門為優(yōu)勢菌群，各組所占比例不同，模型組小鼠變形菌門>厚壁菌門>擬桿菌門，蘘荷水提物小鼠擬桿菌門>厚壁菌門>變形菌門，蘘荷醇溶物組小鼠厚壁菌門>擬桿菌門>變形菌門，醇沉物組變形菌門>擬桿菌門>厚壁菌門。與模型組比較，蘘荷水提物、醇溶物組小鼠擬桿菌門、厚壁菌門的相對豐度升高，變形菌門降低；蘘荷醇沉物組變形菌門、擬桿菌門的相對豐度升高，厚壁菌門降低。

3.4.2 對慢性傳輸型便秘小鼠腸道菌群α多樣性指數(shù)的影響 α多樣性指數(shù)是評價單個體內微生物群落豐富度和多樣性的統(tǒng)計學分析指標，Sobs、Chao 1 指數(shù)是評價小鼠腸道菌群的物種豐富度指標，數(shù)值越大豐富度越高；Shannon、Simpson指數(shù)評價物種多樣性指標，數(shù)值越大多樣性越高[11]。由表2可知，與正常組比較，模型組Sobs、Chao 1、Shannon、Simpson指數(shù)均降低(P<0.05，P<0.01)，表明模型組小鼠菌群豐富度及多樣性均降低；與模型組比較，蘘荷水提物組、大黃通便顆粒組各指數(shù)均升高(P<0.05，P<0.01)，蘘荷醇溶物組Chao 1、Simpson指數(shù)升高(P<0.05)；與蘘荷水提物組比較，醇沉物組各指數(shù)均降低(P<0.05)，醇溶物組Sobs、Shannon指數(shù)降低(P<0.05)。表明蘘荷水提物、醇溶物能調節(jié)便秘小鼠腸道菌群的豐富度及多樣性，以水提物調節(jié)作用最佳，醇沉物無調節(jié)作用。

3.4.3 對慢性傳輸型便秘小鼠腸道菌群β多樣性的影響 非度量多維尺度法統(tǒng)計(non-metric multidimensional scaling，NMDS)主要通過樣本點與點之間的距離評價樣本間微生物群落組成的相似性，即樣本點距離越近則物種組成越相似，越遠則物種組成差異越大[12]；以stress值評估模型的可靠性，值越小評估樣本間的差異性就越準確，一般stress值小于0.1表示模型較可靠。各組樣本間均具有一定的距離，其中蘘荷水提物組與正常組、大黃通便顆粒組距離較近，與模型組和蘘荷醇溶物、醇沉物組距離較遠；與蘘荷醇沉物組比較，蘘荷醇溶物組樣本距離模型組距離較遠。由圖4可知，stress小于0.1，表明NMDS法能準確評價蘘荷各提取物對慢性傳輸型便秘小鼠腸道菌群引起的差異性，提示各組間腸道菌群物種組成存在差異。

表2 蘘荷不同提取物對慢性傳輸型便秘小鼠腸道菌群α多樣性指數(shù)的影響

4 討論

人體結腸有AQP1～AQP4、AQP8～AQP9表達，分別參與結腸水分吸收與分泌，其表達異?？梢鹑绫忝?、腹瀉等腸道疾病[13-15]。慢性傳輸型便秘患者切除的結腸中AQP3表達增加，表明AQP3在該病發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[16]。在多種因素影響下，腸道菌群失調，導致腸蠕動減慢，水分吸收增加，引發(fā)慢性傳輸型便秘，故改善腸道菌群失調已成為治療該病的新靶點[17]。

目前治療慢性傳輸型便秘常用藥物有促動力藥、刺激性及滲透性瀉藥等，臨床療效欠佳，且副作用明顯[17]。膳食纖維被推薦用于慢性便秘的基礎治療[18]，增加膳食纖維攝入可降低便秘發(fā)病率[19]，但也有研究得出相反觀點[20]。中藥多組分、多途徑、多靶點治療疾病且副作用小的特點決定其臨床治療的優(yōu)勢[21]，研究發(fā)現(xiàn)大黃、霍山石斛、增液湯等可通過調節(jié)腸道AQP表達及腸道菌群緩解便秘小鼠癥狀[22-23]；復方益氣養(yǎng)陰通便湯、黃芪潤腸丸能有效提高便秘患者有益菌比例，改善患者癥狀，且遠期療效明顯[24-25]，表明中藥可通過調節(jié)腸道菌群、改善結腸AQP表達治療便秘。

蘘荷中粗纖維含量達28%[4]，是其促消化的物質基礎。蘘荷水提物能促進腸蠕動，從而促排便，改善便秘小鼠癥狀。植物中膳食纖維分為水溶性和水不溶性(醇溶)膳食纖維[26]，因此，將蘘荷水提物溶液中加入乙醇，將其分離為醇沉物和醇溶物，與水提物比較對慢性傳輸型便秘小鼠的作用，以篩選最佳有效部位。結果發(fā)現(xiàn)，蘘荷水提物可促進慢性傳輸型便秘小鼠排便，降低AQP3表達，提高腸道有益菌的比例及菌群豐富度、多樣性，且作用優(yōu)于醇溶物、醇沉物組；蘘荷醇溶物組促排便、調節(jié)腸道菌群的作用優(yōu)于醇沉物；蘘荷醇沉物組降低AQP3表達的作用優(yōu)于醇溶物組。

藥效物質基礎研究是中藥研究的根本問題[27]，隨著中藥化學分離及活性追蹤技術的發(fā)展，從中藥中獲得有效部位或單體物質用于藥效學研究成為可能，但只能分離出少數(shù)活性較強的成分，大部分中藥成分純度越高療效越差，甚至無效，而單味中藥或與其他中藥組成復方多組分，協(xié)同發(fā)揮了較好的藥理效應，體現(xiàn)了中藥治療的整體觀[28]。綜上所述，蘘荷水提物是抗慢性傳輸型便秘小鼠最有效的部位。