曾永長， 梁少瑜*， 姜倩倩， 吳俊洪， 劉常青， 宋力飛， 吳正治*

(1.深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518035；2.深圳市老年醫(yī)學(xué)研究所，廣東 深圳 518020；3.廣州澤力醫(yī)藥科技有限公司，廣東 廣州 510663)

老年性癡呆也叫阿爾茨海默病，是一種典型的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病因不明，臨床一線用藥以乙酰膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天門冬氨酸受體拮抗劑為主，兩者只能控制癥狀，不能終止病程發(fā)展，且具有嚴(yán)重的不良反應(yīng)。以傳統(tǒng)中藥延緩輕度認(rèn)知障礙向老年性癡呆的轉(zhuǎn)化、終止甚至逆轉(zhuǎn)老年性癡呆的發(fā)展進(jìn)程的研究逐漸成為熱點(diǎn)。

中醫(yī)認(rèn)為，老年性癡呆病位在腦，五臟虛損為本，尤以腎為要。腎虛精虧、髓海不足是癡呆的基本病機(jī)。肝腎同源，腎水不足則水不涵木，精血虧虛，肝腎俱損。枸杞子是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥食同源中藥材之一，其味甘，性平，歸肝腎經(jīng)，有滋肝補(bǔ)腎、益精明目之功。藥理研究顯示，枸杞子具有抗氧化、抗衰老、神經(jīng)保護(hù)、保肝、抗腫瘤等作用。枸杞子能逆轉(zhuǎn)Aβ神經(jīng)毒性，減弱因同型半胱氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡，增加SOD活性，降低MDA水平，上調(diào)α7nAChR表達(dá)等發(fā)揮抗衰老、神經(jīng)保護(hù)、抗阿爾茨海默病作用[1-3]，但其活性成分如何協(xié)同整合影響疾病網(wǎng)絡(luò)尚未清楚。本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接相結(jié)合的方法，系統(tǒng)研究枸杞子防治老年性癡呆“活性成分-靶點(diǎn)-通路”的復(fù)雜關(guān)系，為枸杞子防治老年性癡呆的臨床使用提供科學(xué)依據(jù)，為藥食同源中草藥大健康產(chǎn)品開發(fā)提供借鑒。

1 材料

1.1 試劑與藥物 枸杞子(批號(hào)20210219)購自廣州紫云軒藥業(yè)有限公司。PC-12高分化細(xì)胞(批號(hào)PD20180827)、胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；TRIzol購自廣州洪祥生物醫(yī)藥科技股份有限公司；RPMI 1640及引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 數(shù)據(jù)庫與軟件 中藥系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫及分析平臺(tái)(TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)；中藥數(shù)據(jù)庫@ Taiwan(TCM@Taiwan，http://tcm.cmu.edu.tw/)；中藥整合數(shù)據(jù)庫(TCMID, http://www.megabionet.org/tcmid/)；PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)；PubChem(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/)；治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)；String 11.0(https://string-db.org/)；DAVID Bioinformatics Resources 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)；Protein Data Bank(PDB，http://www.rcsb.org/)；SYBYL-X1.3；Cytoscape 3.8.2。

2 方法

2.1 化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫構(gòu)建 以枸杞子為關(guān)鍵詞，檢索TCMSP、TCM@Taiwan及TCMID數(shù)據(jù)庫，獲取其化學(xué)成分信息，遵循藥物活性成分篩選條件，優(yōu)選口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-like，DL)≥0.18者。另外，通過文獻(xiàn)檢索補(bǔ)充不在上述篩選范圍內(nèi)，但也具有明顯生理活性的成分。

2.2 候選靶點(diǎn)及抗老年性癡呆潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過TCMSP和PubChem檢索枸杞子候選活性成分的三維化學(xué)結(jié)構(gòu)，保存為mol2格式，將其輸入PharmMapper執(zhí)行反向?qū)樱詅it score≥3.5為條件，優(yōu)化候選活性靶點(diǎn)。采用TTD、TCMSP數(shù)據(jù)庫查找候選靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的疾病，并將其分類“mild cognitive impairment，Alzheimer disease，dementia”的靶點(diǎn)作為枸杞子防治老年性癡呆的潛在靶點(diǎn)。

2.3 可視化網(wǎng)絡(luò)、蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及相關(guān)靶點(diǎn)通路和生物信息學(xué)分析 分別將枸杞子“候選活性成分-候選靶點(diǎn)”，防治老年性癡呆的“潛在活性成分-潛在靶點(diǎn)-通路”關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape，構(gòu)建“候選成分-候選靶點(diǎn)(candidate compounds-candidate targets，cC-cT)”和“防治老年性癡呆潛在成分-潛在靶點(diǎn)-通路(potential compounds-potential targets-pathways，pC-pT-P)”可視化網(wǎng)絡(luò)。將枸杞子作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String，設(shè)定“Homosapiens，high confidence 0.7”，獲取蛋白相互作用關(guān)系，將蛋白相互關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，并篩選關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)，將枸杞子防治老年性癡呆的潛在活性靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID，進(jìn)行 GO(gene ontology)和 KEGG(Kyoto encyclopediaof genes and genomes)分析。

2.4 活性成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接研究 基于Tripos力場(chǎng)對(duì)活性分子進(jìn)行能量優(yōu)化，獲得最低能量構(gòu)象，建立枸杞子對(duì)接化合物庫。PDB數(shù)據(jù)庫下載HSD11B1、INSR、NR3C1、RARA、CASP3、MAPK14、GSK3B、NOS2晶體結(jié)構(gòu)，在Dock Ligands中對(duì)蛋白晶體去水，加氫，能量優(yōu)化，選擇晶體本身的Ligand模式產(chǎn)生活性口袋，保存為sfxc格式。采用Surflex-dock模塊對(duì)上述潛在活性成分和靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接及打分。

2.5 Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞GSK3B、MAPK14、ESR1、NOS2、CASP3 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用回流提取法制備枸杞子水提物，減壓干燥成浸膏粉，得率約為56.87%，采用無菌水配制成10 g/L，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，臨用前用無菌PBS分別稀釋至5.0、1.0 mg/mL。采用RT-qPCR法，取對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，分為對(duì)照組、模型組及枸杞子水提物1.0、5.0 mg/mL組，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，接種于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育24 h，棄去原培養(yǎng)基，加入相應(yīng)藥物溶液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，再加入Aβ25-35溶液使體系中Aβ25-35終濃度為25 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，各組細(xì)胞處理結(jié)束后PBS潤洗，TRIzol裂解液使細(xì)胞充分裂解提取RNA，并轉(zhuǎn)錄成cDNA，特定引物(序列見表1)對(duì)各目的基因反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)45次。以GAPDH為內(nèi)參基因，2-△△CT法計(jì)算各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

2.6 Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞CASP3蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法，按“2.5”項(xiàng)下方法分組后作用于PC12細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，PBS潤洗3次，加入裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、14 000 r/min離心15 min，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取各組蛋白40 μg，SDS-PAGE電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜后，加封閉液稀釋的兔抗鼠一抗CASP3(1∶1 000)，在4 ℃下過夜孵育，TBST洗膜3次，每次15 min，加封閉液稀釋的HRP標(biāo)記二抗(1∶10 000)，室溫下靜置1 h，TBST洗膜3次，每次15 min，ECL顯影，X光膠片曝光，洗片。

3 結(jié)果

3.1 枸杞子活性成分及靶點(diǎn)篩選 共獲得枸杞子192種成分，滿足OB≥30%、DL≥0.18者共46種，主要包括甾體、萜類、黃酮、含氮類等。此外，spermidine(亞精胺，OB=45.41%，DL=0.02)、cystadane(甜菜堿，OB=40.92%，DL=0.01)、neoxanthin(新黃質(zhì)，OB=28.92%，DL=0.5)、cryptoxanthin(隱黃質(zhì)，OB=25.16%，DL=0.57)、zeaxanthin(玉米黃素，OB=21.17%，DL=0.54)、lutein(葉黃素，OB=15.74%，DL=0.54)、vitamin C(維生素C，OB=13.34%，DL=0.04)。盡管OB或DL值較低，但考慮它們?cè)谒幉闹械暮考吧砘钚訹4-7]，仍然保留其做進(jìn)一步的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)以確保實(shí)驗(yàn)周全性和準(zhǔn)確性，具體見表2。

表2 枸杞子53種候選成分

將上述成分的mol2格式輸入Pharmmapper，進(jìn)行反向藥效團(tuán)匹配，共預(yù)測(cè)269個(gè)高匹配度靶點(diǎn)，其中與老年性癡呆相關(guān)的潛在靶點(diǎn)共31個(gè)，包括HSD11B1(11-β-羥化內(nèi)固醇脫氫酶1)、RARB(β維甲酸受體)、NR3C1(糖皮質(zhì)激素受體)、RARA(α維甲酸受體)、CALM1(鈣調(diào)蛋白)、KIT(肥大/干細(xì)胞生長因子受體)、IGF1(胰島素樣生長因子)、F2(凝血酶原)、FGFR1(堿性成纖維細(xì)胞生長因子受體1)、MET(肝細(xì)胞生長因子受體)、MAPK10(絲裂原活化蛋白激酶10)、MAPK14(絲裂原活化蛋白激酶14)、CASP3(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3)、PDE4D (cAMP特異性3,5-環(huán)磷酸二酯酶4D)、KDR(血管內(nèi)皮生長因子受體2)、INSR(胰島素受體)、F11(凝血因子XI)、PPARG(過氧化物酶體增殖物激活受體γ)、ESR2(β雌激素受體)、BACE1(β分泌酶)、HMOX1(血紅素加氧酶1)、GSK3B(糖原合成酶激酶-3β)、ESR1(雌激素受體)、F7(凝血因子Ⅶ)、PPARD(過氧化物酶體增殖物激活受體δ)、SOD2(超氧化物歧化酶)、PDE4B(cAMP特異性3,5-環(huán)磷酸二酯酶4B)、NOS2(一氧化氮合酶，誘導(dǎo)型)、RAC1(Ras相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物)、MAOB(胺氧化酶B)、ACE(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶)。

3.2 枸杞子cC-cT網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、PPI網(wǎng)絡(luò)分析及GO、KEGG富集分析 將53種候選成分和269個(gè)候選靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到“cC-cT”網(wǎng)絡(luò)(圖1A)，藍(lán)色圓圈代表候選成分，紅色菱形代表候選靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)大小代表相應(yīng)的度(Degree)，共322個(gè)節(jié)點(diǎn)和3 472條相互作用關(guān)系，平均相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)21.57，充分體現(xiàn)枸杞子多成分、多靶點(diǎn)調(diào)控疾病的網(wǎng)絡(luò)特征?！癱C-cT”網(wǎng)絡(luò)中Degree(D)最高的10種候選成分包括M49(neoxanthin，新黃質(zhì)，D=131)、M35(cryptoxanthin monoepoxide，隱黃素環(huán)氧化物，D=126)、M02(31-norcyclolaudenol，去甲環(huán)鴉片甾烯醇，D=110)、M36(δ-carotene δ-胡蘿卜素，D=97)、M33(β-carotene，β-胡蘿卜素，D=95)、M50(cryptoxanthin，隱黃素，D=95)、M51(zeaxanthin，玉米黃質(zhì)，D=95)、M41(physalin A，酸漿苦味素，D=93)、M52(lutein，葉黃素，D=91)、M04(cycloeucalenol，環(huán)桉烯醇，D=81)，Degree最高的10個(gè)候選靶點(diǎn)分別為MAP2K1、HNMT、RXRB、FECH、FABP7、SULT2B1、HSD11B1、CRABP2、RARB、PCTP，靶點(diǎn)與疾病的對(duì)應(yīng)關(guān)系見表3(前10)，提示枸杞子與腫瘤、炎癥、肝損傷、認(rèn)知障礙、神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)。

表3 枸杞子10個(gè)關(guān)鍵候選靶點(diǎn)、拓?fù)鋮?shù)及疾病對(duì)應(yīng)關(guān)系

通過String構(gòu)建枸杞子活性靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖1B)，共233個(gè)節(jié)點(diǎn)和918條相互關(guān)系。通過節(jié)點(diǎn)度≥15篩選枸杞子關(guān)鍵靶點(diǎn)，獲得包括SRC、PIK3R1、HRAS、EGFR、HSP90AA1、MAPK14、GRB2、IGF1、PRKACA、RAC1、RXRA等31個(gè)蛋白，主要參與細(xì)胞免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)ER應(yīng)激和自噬、調(diào)控細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、反向調(diào)節(jié)抗病毒基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控樹突棘形成、突觸可塑性等生理過程。

以P<0.01為條件，枸杞子活性靶點(diǎn)GO富集分析共獲得269條GO條目，包含180個(gè)生物過程(biological process，BP)、26個(gè)細(xì)胞組成(cellular component，CC)、63個(gè)分子功能(molecular function，MF)，見圖1C(前10)，涉及類固醇激素介導(dǎo)信號(hào)通路、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始、肽基酪氨酸自磷酸化、蛋白質(zhì)自磷酸化、凋亡過程負(fù)調(diào)控等生物學(xué)過程，發(fā)揮調(diào)節(jié)類固醇激素受體活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、ATP結(jié)合及酶結(jié)合等功能。以P<0.01為條件，枸杞子活性靶點(diǎn)KEGG通路富集分析共獲得60條信號(hào)通路，涉及各類癌癥、胰島素信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路等。

3.3 枸杞子防治老年性癡呆“pC-pT-P”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及通路分析 將枸杞子防治老年性癡呆的“潛在活性成分-靶點(diǎn)-通路”相互作用關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得 “pC-pT-P”網(wǎng)絡(luò)(圖2A)，共98個(gè)節(jié)點(diǎn)(50種活性成分、31個(gè)活性靶點(diǎn)、17條信號(hào)通路)和567條相互作用關(guān)系。通過Cytohubba設(shè)定Maximal Clique Centrality(MCC)為30，構(gòu)建枸杞子防治老年性癡呆C-T關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)(圖2B)及各關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)得分圖(圖2C)，可知枸杞子防治老年性癡呆的關(guān)鍵活性成分包括M35-隱黃素環(huán)氧化物、M49-新黃質(zhì)、M02-去甲環(huán)鴉片甾烯醇、M33-β-胡蘿卜素、M36-δ-胡蘿卜素、M50-隱黃素、M52-葉黃素、M14-鈍葉醇、M18-羊毛甾醇、M07-環(huán)阿屯醇、M51-玉米黃質(zhì)、M09-花色素苷等，關(guān)鍵靶點(diǎn)包括HSD11B1、NR3C1、RARB、CALM1、RARA、KIT、IGF1、F2、FGFR1、MET、MAPK10、CASP3、MAPK14等。KEGG通路富集分析(前10，圖2D)顯示，枸杞子防治老年性癡呆31個(gè)潛在靶點(diǎn)主要涉及癌癥通路、Rap1信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)通路、多巴胺能突觸、HIF-1信號(hào)通路及炎癥通路等。

3.4 分子對(duì)接研究 將枸杞子潛在活性成分neoxanthin(新黃質(zhì))、cyanin(花色素苷)、cryptoxanthin monoepoxide(隱黃素環(huán)氧化物)、δ-carotene(δ-胡蘿卜素)、isofucosterol(異巖藻甾苷)、β-carotene(β-胡蘿卜素)、cryptoxanthin(隱黃素)、zeaxanthin(玉米黃質(zhì))與老年性癡呆核心靶點(diǎn)HSD11B1-2ILT、INSR-5ELS、NR3C1-3BQD、RARA-3kmr、CASP3-1gfw、MAPK14-6sfo、GSK3B-6hk4及NOS2-4nos進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見表4、圖3。其中，cyanin(花色素苷)、cryptoxanthin monoepoxide(隱黃素環(huán)氧化物)、cryptoxanthin(隱黃素)對(duì)HSD11B1，cyanin(花色素苷)、cryptoxanthin monoepoxide(隱黃素環(huán)氧化物)、cryptoxanthin(隱黃素)、δ-carotene(δ-胡蘿卜素)對(duì)INSR，β-carotene(β-胡蘿卜素)、cyanin(花色素苷)、cryptoxanthin monoepoxide(隱黃素環(huán)氧化物)對(duì)CASP3，cyanin(花色素苷)對(duì)GSK3B，δ-carotene(δ-胡蘿卜素)對(duì)NOS2結(jié)合得分大于6.0且配體與受體對(duì)接時(shí)不適程度較小，結(jié)合良好。

表4 枸杞子防治老年性癡呆關(guān)鍵活性成分與靶點(diǎn)對(duì)接得分

3.5 枸杞子水提物對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞GSK3B、MAPK14、ESR1、NOS2及CASP3 mRNA表達(dá)的影響 所選引物特異性良好，見圖4A。與對(duì)照組比較，模型組GSK3B、MAPK14、NOS2及CASP3 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)，ESR1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組比較，1.0、5.0 mg/mL枸杞子水提物組可抑制GSK3B、NOS2、CASP3 mRNA表達(dá)(P<0.05)，上調(diào)ESR1 mRNA表達(dá)(P<0.05)，見圖4B。

3.6 枸杞子水提物對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞CASP3蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組CASP3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，1.0、5.0 mg/mL枸杞子水提物組可抑制CASP3蛋白表達(dá)(P<0.05)，見圖5。

4 討論

老年性癡呆的發(fā)生是一個(gè)連續(xù)的病理過程，經(jīng)歷輕度認(rèn)知障礙前期、輕度認(rèn)知障礙期以及癡呆期。現(xiàn)有關(guān)于老年性癡呆的研究多集中在癡呆期，但這一階段神經(jīng)元已出現(xiàn)大量死亡，病理進(jìn)程難以逆轉(zhuǎn)，針對(duì)此階段所開發(fā)的藥物效果并不理想。將基礎(chǔ)和臨床研究的窗口前移，采用藥食同源的中藥材進(jìn)行早期干預(yù)，實(shí)現(xiàn)延緩或阻止老年性癡呆的發(fā)展進(jìn)程意義重大。

枸杞子著稱補(bǔ)肝益腎的“卻老子”，其成分豐富，含多糖類、黃酮類、萜類、甾體化合物、生物堿等活性成分，使其具有豐富的營養(yǎng)和生物活性，如抗腫瘤、抗增殖、抗氧化、保護(hù)中樞神經(jīng)、抗動(dòng)脈硬化等作用。本研究發(fā)現(xiàn)，枸杞子中隱黃素、新黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、δ-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質(zhì)等為枸杞子防治老年性癡呆的主要活性成分。類胡蘿卜素作為生命所必須的脂溶性色素，其具有顯著的維生素A原活性、抗氧化、抗腫瘤、保肝、神經(jīng)保護(hù)、提高免疫力和抗炎等作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，β-胡蘿卜素具有提高SOD和GSH-Px的酶活性[8]，促進(jìn)PPARG表達(dá)的同時(shí)抑制CASP3、CASP9、COX2、NF-κB的表達(dá)[9-10]，發(fā)揮抗炎、抗氧化的作用。葉黃素作為人腦中含量最高的類胡蘿卜素，其通過上調(diào)PPARγ、RXRα、IGF1、Bcl-2、GSK-3β和p-Akt的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[11-13]。玉米黃質(zhì)具有增強(qiáng)抗氧化酶SOD、GSH-Px酶活性的作用[14]，其通過增加Akt表達(dá)，降低GSK-3β、Bax和CASP3的水平，激活A(yù)kt信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激[15]。枸杞子防治老年性癡呆的活性靶點(diǎn)主要包括11β-羥類固醇脫氫酶1(HSD11B1)、β維甲酸受體(RARB)、糖皮質(zhì)激素受體(NR3C1)、α維甲酸受體(RARA)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(CASP3)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、糖原合成酶激酶-3β(GSK3B)，雌激素受體(ESR1)、胰島素樣生長因子(IGF1)等。HSD11B1作為糖皮質(zhì)激素的代謝酶，其通過氧化還原將體內(nèi)無活性的皮質(zhì)酮轉(zhuǎn)化為有活性的皮質(zhì)醇，致使局部糖皮質(zhì)激素水平過高進(jìn)而損傷海馬，影響認(rèn)知功能[16]。維甲酸類受體屬于類固醇和甲狀腺激素受體家族，包括RARs和RXRs。RARA和RARB作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在杏仁核、前額葉皮層和大腦廣泛表達(dá)，其通過識(shí)別靶基因的RARE調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，參與維持上皮組織的再生，免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，影響突觸生長形成。RARB通過HIF1α信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)促進(jìn)線粒體的增殖和生長錐移動(dòng)的速度，通過增加細(xì)胞內(nèi)cAMP水平促進(jìn)神經(jīng)突起生長[17]。RARA作為海馬組織優(yōu)勢(shì)核受體，其通過促進(jìn)胞漿中GluR1翻譯誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元樹突棘的形成[18]。胰島素樣生長因子IGF-1可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路和ERK通路，增加Bcl-2的表達(dá)，抑制CASP3的活性抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[19-20]；通過增強(qiáng)L型鈣通道電流，使轉(zhuǎn)錄因子C/EBP β水平下降，抑制NMDA受體調(diào)節(jié)的鈣內(nèi)流，促進(jìn)小腦顆粒神經(jīng)元存活，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[21]。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接相結(jié)合的方法探討藥食同源枸杞子防治老年性癡呆的作用機(jī)制，構(gòu)建了枸杞子50個(gè)活性成分作用于31個(gè)潛在靶點(diǎn)，通過Ras信號(hào)，PI3K-Akt信號(hào)，神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)，多巴胺能神經(jīng)突觸，HIF-1信號(hào)等通路調(diào)控老年性癡呆的疾病網(wǎng)絡(luò)。本研究系統(tǒng)揭示了藥食同源枸杞子防治老年性癡呆的“活性成分-靶點(diǎn)-通路”的復(fù)雜關(guān)系，為藥食同源中草藥枸杞子臨床使用提供了理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。