龍 偉， 溫芝琪， 吳 東， 黃玉林， 李夢楚， 龔建平*， 劉 圓， 薛敬民，黃文平*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；2.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌 330006；3.山東省泰安榮軍醫(yī)院，山東 泰安 271000；4.華北理工大學(xué)，河北 唐山 063210)

顯脈旋覆花為菊科植物顯脈旋覆花InulanervosaWall. Ex DC 的干燥根及根莖[1]，富含多種維生素和礦物質(zhì)[2]，根主要含油類成分[3]，可作為防腐劑、殺菌劑、肝功能試劑等[4]，全株無明顯毒性，并具有平喘祛痰、抗炎抑菌、抗氧化的作用[3,5-8]，但已有文獻(xiàn)主要針對根[9-11]，鮮有涉及花序。因此，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-QTOF-MS/MS 法對顯脈旋覆花花序化學(xué)成分進(jìn)行分析，同時對其進(jìn)行抗補(bǔ)體活性評價，以期初步評價該植物增加免疫力的功效，并為其未來作為食品資源的可能性提供依據(jù)。

1 材料

LC-30A 超高效液相色譜儀(日本島津公司)；Triple-TOF 5600高分辨質(zhì)譜儀，配置ESI 離子源、Analyst 1.6數(shù)據(jù)處理軟件、Peak View數(shù)據(jù)處理軟件(美國AB SCIEX 公司)；HC-3018R型高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；Millipore-Simplicity 超純水處理系統(tǒng)(德國默克密理博公司)；KQ-400DB型超聲清洗機(jī)(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；AL204 型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

綠原酸(批號110768-200504)、咖啡酸(批號110885-201703)、大黃素(批號 110756-201913)、槲皮素(批號100081-201610)對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；新綠原酸(批號BCY-190219)、隱綠原酸(批號BCY-190315)、東莨菪苷(批號BCY-190822)、木犀草素-3,7-二-O-葡萄糖苷(批號BCY-181103)、旋覆花內(nèi)酯(批號BCY-191025)、3,5-二咖啡酸(批號BCY-190906)對照品均購于江西佰草源生物科技有限公司。顯脈旋覆花干燥花序經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)龔建平教授鑒定為菊科植物顯脈旋覆花InulanervosaWall.的花序。甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法

2.1 UHPLC-QTOF-MS/MS 分析

2.1.1 色譜 Agilent Poroshell 120 C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)；流動相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0.01～4 min，2%B；4～6 min，2%～5%B ；6～10 min，5%～10%B；10～22 min，10%～18%B；22～32 min，18%～25%B；32～42 min，25%～70%B；42～52 min，70%～2%B；52～55 min，2%B)；體積流量0.25 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜 電噴霧電離源(ESI)，負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z100 ～1 200；噴霧電壓 -4 500 V；霧化氣溫度600 ℃；氣簾氣172.36 kPa；霧化氣和輔助氣344.74 kPa；去簇電壓-100 V；TOF-MS-IDA-MS/MS法采集數(shù)據(jù)，TOF/MS一級預(yù)掃描、觸發(fā)的二級掃描TOF/MS/MS 離子累積時間分別為500、200 ms；CE碰撞能量-35 eV。

2.2 對照品溶液制備 精密取綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、3,5-二咖啡?？鼘幩帷|莨菪苷、槲皮素、大黃素、木犀草素-3,7,-二-O-葡萄糖苷、旋覆花內(nèi)酯對照品適量，甲醇制成0.05 mg/mL溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取粉末(過四號篩)0.2 g，加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，回流提取30 min，放冷，濾過，12 000 r/min離心，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4 抗補(bǔ)體活性測定 參照文獻(xiàn)[12]報(bào)道的方法進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 化學(xué)成分鑒定 總離子流圖見圖1，具體信息見表1。

表1 顯脈旋覆花花序中化學(xué)成分

3.2 酚酸類成分分析 咖啡酸，分子式為C9H8O4，負(fù)離子模式下m/z179.034 7；二級碎片離子峰m/z161.038 0、135.045 6、134.037 3、107.051 1，其中m/z161.038 0比母離子少18 Da，為2個羥基縮合脫水所致；m/z135.045 6比母離子少44Da，為咖啡酸母核失去CO2的碎片，再進(jìn)一步失去CO，得到m/z107.051 1的碎片離子，裂解途徑見圖2。

3.3 黃酮類成分分析 木犀草素-3,7-二-O-葡萄糖苷，分子式為C27H30O16，負(fù)離子模式下m/z609.185 4；二級碎片離子峰m/z447.097 0、285.041 1、257.027 5，其中m/z447.097 0比母離子少162 Da，為母核失去1個葡萄糖所致；m/z285.041 1比m/z447.097 0少162 Da，為母核再失去1個葡萄糖所致；m/z257.027 5為木犀草素母核進(jìn)一步失去CO的碎片離子所致，其裂解途徑見圖3。

3.4 其他成分分析 旋覆花內(nèi)酯，分子式為C15H22O4，負(fù)離子模式下m/z265.146 1；二級碎片離子峰m/z221.157 7；碎片離子比母離子少44 Da，為母核失去1個CO2所致。大黃素，分子式為C15H10O5，負(fù)離子模式下m/z269.047 5；二級碎片離子峰m/z227.113 6、199.033 2，其中m/z227.113 6比m/z269.047 5少42 Da，為母核失去1個CO、1個CH2所致；m/z199.033 2比m/z227.113 6少28 Da，為進(jìn)一步失去CO碎片離子所致，其裂解途徑見圖4。

3.5 抗補(bǔ)體活性研究 將效價及活性測試豚鼠血清(補(bǔ)體)用BBS 對倍稀釋成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256 后加到溶血體系中，發(fā)現(xiàn)在1∶2～1∶32 時溶血率接近100%，即基本達(dá)到全溶血，為確保體系能全部溶血，并提高藥物篩選時方法的靈敏度，本實(shí)驗(yàn)選擇1∶32，結(jié)果見表2。由此可知，綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸CH50與陽性藥(肝素鈉)相近，強(qiáng)于香豆素、黃酮、蒽醌。

4 討論

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)能夠快速對復(fù)雜的化學(xué)成分體系進(jìn)行分析[26-28]。本實(shí)驗(yàn)建立基于UHPLC-QTOF-MS/MS聯(lián)用技術(shù)分析顯脈旋覆花花序中的化學(xué)成分，并結(jié)合相關(guān)對照品和參考文獻(xiàn)，共鑒定成分32種，其化學(xué)成分主要為黃酮和酚酸類成分，并含諸多其他類成分如香豆素、蒽醌及苷類等物質(zhì)。酚酸類如咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸等，都具有抗炎、抗氧化的作用；黃酮類如槲皮素、木犀草素等，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌等作用，這些成分都為顯脈旋覆花花序在抗炎、抗氧化等作用提供較好的物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，對鑒定的部分黃酮和酚酸類化合物進(jìn)行了經(jīng)典抗補(bǔ)體活性的測定，發(fā)現(xiàn)綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸等具有一定的抗補(bǔ)體活性，而特征性旋覆花內(nèi)酯成分抗補(bǔ)體效果不強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)為顯脈旋覆花花序的化學(xué)成分的研究及評價花序在增強(qiáng)免疫方面的功效提供一定的依據(jù)，并為后續(xù)顯脈旋覆花花序質(zhì)量評價及藥理活性及其機(jī)制研究提供了詳實(shí)的數(shù)據(jù)支撐，對未來顯脈旋覆花花序進(jìn)入食品資源目錄的可能性奠定研究基礎(chǔ)。

表2 各成分CH50測定結(jié)果