周 靜，張華丹，火玉明，雷彩玲，杜希萍，梁 鵬,*，程文健，陳麗嬌

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.閩臺(tái)特色海洋食品加工及營(yíng)養(yǎng)健康教育部工程研究中心，福建 福州 350002；3.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021）

魚露制品因其獨(dú)特的香氣和口感深受消費(fèi)者歡迎。研究表明，魚露富含人體所需的必需氨基酸、多種礦物質(zhì)元素和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，此外，魚露還具有降血壓、降低膽固醇、抗氧化等生理功效[1]。傳統(tǒng)魚露工藝是由低價(jià)值魚類或加工過的魚類廢棄物與鹽混合制成，通過水解和微生物發(fā)酵，發(fā)酵過程通常需要6～18 個(gè)月[2]。并且可能會(huì)產(chǎn)生讓人難以接受的不良?xì)馕?。因此，近年來?guó)內(nèi)外學(xué)者研究出外加酶、外加曲和保溫發(fā)酵等快速發(fā)酵技術(shù)[3]，如Nguyen等[4]從魚露發(fā)酵池中分離了SPQ耐鹽桿菌（Marinococcus halotoleransSPQ）并接種到鳳尾魚魚露的發(fā)酵液中進(jìn)行發(fā)酵。結(jié)果表明在接種后第6個(gè)月的培養(yǎng)液中氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度為2.52 g/L，高于對(duì)照組的2.21 g/L，組胺質(zhì)量濃度為110.12 mg/L，低于200 mg/L的最大允許安全限值，天冬氨酸和谷氨酸分別增加23.5%和35.1%。Lopetcharat等[5]通過研究發(fā)現(xiàn)，太平洋鱈魚魚露在50 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，魚露中總氮含量在15 d時(shí)就達(dá)到了商售魚露的水平，說明保溫發(fā)酵可以加快魚露的成熟。Rabie等[6]以鯖魚為原料，添加菠蘿蛋白酶制備魚露，在不影響產(chǎn)品質(zhì)量的前提下將魚露的發(fā)酵時(shí)間縮短至90 d。由此可見，快速發(fā)酵工藝不僅可以縮短傳統(tǒng)魚露的發(fā)酵周期，還可以改善魚露的風(fēng)味、提高魚露的品質(zhì)。大黃魚是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚類之一，其加工副產(chǎn)物魚卵因富含二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosapentaenoic acid，DHA）以及人體所需的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有較高的開發(fā)利用價(jià)值[7]。有望作為魚露發(fā)酵的優(yōu)質(zhì)原料，但目前這方面的研究較少。

代謝組學(xué)包括核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術(shù)、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)和液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）聯(lián)用技術(shù)等[8]。與其他技術(shù)相比，色譜-質(zhì)譜技術(shù)具有靈敏度高、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，而發(fā)酵食品中含有多種小分子代謝物，極性跨度大，并表現(xiàn)出較大的集中動(dòng)態(tài)范圍[9]。因此色譜-質(zhì)譜技術(shù)在發(fā)酵代謝產(chǎn)物分析方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，有望用于分析發(fā)酵食品加工過程中代謝產(chǎn)物組成及其形成機(jī)制。如李文亞等[10]采用GC-MS技術(shù)對(duì)不同溫度下的低鹽蝦醬發(fā)酵過程中的代謝物進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明與傳統(tǒng)蝦醬相比，10 ℃下發(fā)酵的低鹽蝦醬不僅含鹽量降低，而且營(yíng)養(yǎng)特性較高。Lin Fengke等[11]基于氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GCTOF-MS）技術(shù)對(duì)來自中國(guó)西南部的本土發(fā)酵食品——老窩火腿發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果表明大多數(shù)氨基酸的相對(duì)含量在成熟兩年的老窩火腿樣品中最高，食用老窩火腿有助于人類飲食的微生物和化學(xué)多樣性。He Yingxia等[12]將GC-TOF-MS技術(shù)與描述性感官分析相結(jié)合，分析中國(guó)不同地區(qū)的濃香型白酒的差異，結(jié)果表明58種香氣化合物在四川和江淮地區(qū)的樣品中存在顯著差異，揭示此方法在其他酒精飲料的風(fēng)味表征中可能有積極應(yīng)用。

近年來，課題組在大黃魚魚卵魚露發(fā)酵工藝方面開展相關(guān)研究工作，如周靜等[13]通過對(duì)大黃魚魚卵進(jìn)行快速發(fā)酵，得出15%加鹽量、15%加曲量、35 ℃為大黃魚魚卵魚露發(fā)酵的適宜工藝條件。而當(dāng)前采用代謝組學(xué)技術(shù)在魚卵魚露發(fā)酵品質(zhì)方面的研究較少，大黃魚魚卵魚露發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物及其參與的代謝通路尚不明確。因此本實(shí)驗(yàn)以大黃魚魚卵為魚露發(fā)酵原料，采用外加酶、外加曲、保溫發(fā)酵相結(jié)合的方法快速發(fā)酵獲得大黃魚魚卵魚露制品，并嘗試采用代謝組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)地揭示大黃魚魚卵魚露發(fā)酵過程中形成的代謝產(chǎn)物及其代謝通路與形成機(jī)制，旨在為我國(guó)魚露發(fā)酵行業(yè)的發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大黃魚魚卵 福建蔡氏水產(chǎn)有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力為8×105U/g） 北京索萊寶科技有限公司；黑曲精 上海佳民釀造食品有限公司；米曲精 濟(jì)寧玉園生物科技有限公司；鹽、豆粕、麩皮 市購(gòu)；甲醇、乙腈、異丙醇 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；甲氧胺 美國(guó)Sigma公司；雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺（bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，BSTFA） 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H1850-R冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；QL-866混勻儀 Vortex Mixer公司；5305真空濃縮儀 美國(guó)Eppendorf公司；DHG-9240鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；7890B氣相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；Pegasus BT質(zhì)譜儀 美國(guó)LECO公司。

1.3 方法

1.3.1 曲霉的制備

復(fù)合曲由黑曲霉和米曲霉組成，質(zhì)量比為1∶3[14]。

黑曲霉制備：以豆粕和麩皮（質(zhì)量比為豆粕∶麩皮=3∶1）為發(fā)酵基料，80%（水/干料）的去離子水潤(rùn)濕20 min，高壓滅菌鍋120 ℃蒸煮20 min，黑曲霉接種量為0.3%，在30 ℃下培養(yǎng)48 h[14]。

米曲霉制備：以豆粕和麩皮（質(zhì)量比為豆粕∶麩皮=2∶1）為發(fā)酵基料，80%（水/干料）的去離子水潤(rùn)濕20 min，高壓滅菌鍋120 ℃蒸煮20 min，米曲霉接種量為0.3%，在30 ℃下培養(yǎng)44 h[14]。

1.3.2 魚露發(fā)酵工藝

將100 g大黃魚魚卵解凍后剪碎，加入300 g的去離子水（質(zhì)量比為魚卵∶水=1∶3），邊攪拌邊將pH值調(diào)至6.5，加入3 g（魚卵質(zhì)量3%）的木瓜蛋白酶后將混合液放入50 ℃的水浴鍋中酶解4 h（每隔半小時(shí)攪拌1 次），酶解結(jié)束后放入90 ℃水浴鍋中滅酶15 min，拿出后冷卻至室溫，加入酶解液質(zhì)量15%的復(fù)合曲、15%的鹽，放入35 ℃的保溫箱發(fā)酵，每天攪拌1 次，并且每隔5 d取樣1 次（依次命名樣本K-5、K-10、K-15、K-20、K-25、K-30）。

1.3.3 代謝物處理

1）將樣品充分振蕩混勻后，精確移取樣本500 μL于2 mL EP管中，準(zhǔn)確加入500 μL乙腈-異丙醇-水（3∶3∶2，V/V）混合溶液溶液（－20 ℃），渦旋振蕩30 s。2）室溫超聲5 min。3）14 000 r/min離心5 min，取上清液500 μL溶液加入到一新的2 mL EP管中，真空濃縮儀濃縮至盡干（8～10 h），剩余濃縮的上清液放置－80 ℃冰箱備用。4）在濃縮盡干的樣品中，加入80 μL的20 mg/mL甲氧胺吡啶溶液復(fù)溶，渦旋振蕩30 s，60 ℃孵育60 min。5）再最后 加入100 μL BSTFA-TMCS（99∶1，V/V）衍生化試劑，渦旋振蕩30 s，70 ℃條件下孵育90 min，14 000 r/min離心3 min，取上清液90～100 μL加入到檢測(cè)瓶中。6）樣品放置于密封盅內(nèi)暫存待測(cè)，并于24 h內(nèi)完成GC-TOF上機(jī)檢測(cè)[15]。

1.3.4 檢測(cè)條件

GC條件：DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持0.5 min，以15 ℃/min上升到320 ℃，320 ℃，保持9 min；載氣（氦氣）流速1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；分流比1∶10；進(jìn)樣口溫度280 ℃；傳輸線和離子源溫度分別為320 ℃和230 ℃。

MS條件：全掃描方法；掃描速率10 spec/s；電子能量－70 eV；溶劑延時(shí)3 min[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用R（v3.3.2）的XCMS程序包進(jìn)行峰識(shí)別、峰過濾、峰對(duì)齊，得到包括質(zhì)核比和保留時(shí)間及峰面積等信息的數(shù)據(jù)矩陣；結(jié)合AMDIS程序進(jìn)行代謝物的注釋，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行峰面積的總峰面積歸一化。在對(duì)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析之前，需要將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，使用的是帕萊托換算（Pareto scaling，Mean-centering and scaled to pareto variance，Par）。使用SIMCA-P(v13.0)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA），通過R（v3.3.2）中pheatmap程序包對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行縮放，得到代謝物相對(duì)定量值層次聚類圖。通過Metaboanalyst中的MetPA數(shù)據(jù)庫對(duì)差異代謝物的代謝通路進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大黃魚魚卵魚露發(fā)酵過程中代謝物多元統(tǒng)計(jì)分析

2.1.1 PCA結(jié)果

圖1 大黃魚魚卵魚露差異代謝物的PCA得分圖Fig. 1 PCA score plot of differential metabolites in large yellow croaker roe sauce

從圖1可觀察樣品的聚集、離散程度。不同樣品的分布點(diǎn)越靠近，說明這些樣品中所含有的變量（分子）的組成和濃度越接近；反之，樣品點(diǎn)越遠(yuǎn)離，其差異越大。模型的可解釋度為0.506高于0.5，說明所得到的模型準(zhǔn)確性較好。如圖1所示，K-5和K-10組內(nèi)分別有一個(gè)樣品與其余2 個(gè)樣品之間存在一定的距離，可能是實(shí)驗(yàn)存在的誤差導(dǎo)致。其余樣本的平行樣品都較為集中。此外，大黃魚魚卵魚露發(fā)酵5、10、15、20、25 d與30 d的大黃魚魚卵魚露樣本距離較遠(yuǎn)，說明魚露發(fā)酵前期與后期的代謝產(chǎn)物差異較大，變化較為明顯。

2.1.2 OPLS-DA結(jié)果

圖2 大黃魚魚卵魚露差異代謝物的OPLS-DA得分圖Fig. 2 OPLS-DA score plot of differential metabolites in large yellow croaker roe sauce

2.2 大黃魚魚卵魚露發(fā)酵過程中差異代謝物的篩選

根據(jù)P值不大于0.05且變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值不小于1的篩選條件[18]判斷大黃魚魚卵魚露發(fā)酵過程中的明顯差異代謝物，一共得到46種。如表1所示，其中包括10種糖、9種醇、7種氨基酸、6種有機(jī)酸、4種酯、3種醛、1種脂肪酸以及6種其他化合物。通過對(duì)46種初級(jí)代謝物進(jìn)行凝聚層次聚類熱圖分析得到圖3結(jié)果表明，大黃魚魚卵魚露發(fā)酵過程中代謝物被分為2 個(gè)大類，每個(gè)大類有2 個(gè)亞類，共4 個(gè)亞類。第1大類第1亞類有1種醛；第1大類第2亞類有24種，分別為6種糖、5種有機(jī)酸、5種醇、2種酯、1種醛、1種脂肪酸、1種氨基酸和3種其他化合物；第2大類第1亞類有19種，分別為6種氨基酸、4種醇、4種糖、1種醛、1種有機(jī)酸和3種其他化合物；第2大類第2亞類有2種酯。

糖類作為差異代謝物最多的種類，其中的葡萄糖如蜜二糖和3,6-脫水葡萄糖等作為魚露中的主要碳水化合物，隨著魚露發(fā)酵的進(jìn)行，其含量在不斷下降，說明魚露的發(fā)酵過程在不斷消耗碳水化合物。D-木糖存在于動(dòng)物的糖蛋白中，被廣泛應(yīng)用于焙烤食品、水產(chǎn)品、臘肉、等產(chǎn)品的生產(chǎn)、加工中，并且可以改善肉制品的異味。且D-木糖具有活化人體腸道內(nèi)的雙歧桿菌并促進(jìn)其生長(zhǎng)，改善人體的微生態(tài)環(huán)境，提高機(jī)體免疫力的功效[19]。魚露發(fā)酵過程中D-木糖的相對(duì)含量在發(fā)酵15 d及以后有所上升。6-脫氧己糖是由核苷二磷酸激活的己糖通過4-酮-6-脫氧中間物形成，6-脫氧己糖存在于脂多糖、胞外多糖、糖蛋白和不同種類的糖基化次生代謝產(chǎn)物中[20]。在魚露的發(fā)酵過程中，D-木糖和6-脫氧己糖的相對(duì)含量呈增加趨勢(shì)。說明發(fā)酵過程中魚露中的糖蛋白在不斷被消耗，從而產(chǎn)生D-木糖和6-脫氧己糖。

醇類物質(zhì)中的植物鞘氨醇是神經(jīng)酰胺的前體，同時(shí)也是皮膚脂質(zhì)成分之一，Kim等[21]合成了植物鞘氨醇衍生物，并將其應(yīng)用于小鼠成功證明其具有減輕炎癥性皮膚損傷的功能。麥芽糖醇是一種新型的功能性甜味劑，被人體吸收的比例較低，因此可作為糖尿病人的調(diào)味劑[22]。目前麥芽糖醇的主要來源是淀粉，因此魚露中的麥芽糖醇來源最有可能是米曲霉和黑曲霉的培養(yǎng)原料豆粕和麩皮。1-苯乙醇又名蘇合香醇，具有淡梔子花香味，是一種較為重要的食用香料用芳香化合物，被廣泛用于調(diào)配各種食用香精，也被認(rèn)為是發(fā)酵食品的香味貢獻(xiàn)者。Dong Fang等[23]利用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的方法，發(fā)現(xiàn)1-苯乙醇來源于苯丙氨酸通路中的苯乙酮，魚露發(fā)酵過程中的1-苯乙醇的相對(duì)含量不斷上升，30 d的相對(duì)含量較高，這與王潔茹等[24]對(duì)南疆紅棗醋香氣成分分析的研究結(jié)果類似。肌醇被認(rèn)為是一種類似維生素的必需營(yíng)養(yǎng)素，是大多數(shù)水生動(dòng)物的生長(zhǎng)因子。有研究報(bào)道，缺乏肌醇的蝦的消化和食物利用率較低，而隨著肌醇水平的增加，蝦體內(nèi)的消化酶活性提高，消化能力和生長(zhǎng)性能隨之提高[25]。

氨基酸作為魚露獨(dú)特口感的直接原因，在檢測(cè)到的46種明顯差異代謝物中有7種，分別是L-異蘇氨酸、DL-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-苯丙氨酸和L-絲氨酸、DL-焦谷氨酸，其中有4種為人體必需氨基酸（苯丙氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）。異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸為苦味氨基酸，蘇氨酸為甜味氨基酸，另外絲氨酸是魚露鮮味形成的關(guān)鍵氨基酸之一[26]。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，蘇氨酸的相對(duì)含量有所增加，而其余6種氨基酸的含量在不斷減少，這與Wang Yueqi等[9]對(duì)中國(guó)傳統(tǒng)魚露的代謝產(chǎn)物研究結(jié)果一致。

差異代謝物中的有機(jī)酸包括琥珀酸、丁烯二酸、異戊酸、2-{[(芐氧基)羰基]氨基}-4-甲基戊酸、D-阿拉伯酸、D-甘油酸，琥珀酸是鮮味的載體，能夠協(xié)同其他物質(zhì)起到增強(qiáng)呈味的作用，是水產(chǎn)品重要的滋味物質(zhì)之一[27]，琥珀酸（包括鹽類）可產(chǎn)生酸味、呈味，可用于豆醬、調(diào)味料等食品中。D-阿拉伯酸、D-甘油酸、琥珀酸、2-{[(芐氧基)羰基]氨基}-4-甲基戊酸、異戊酸和EPA都隨著發(fā)酵的進(jìn)行含量不斷增加，特別是D-阿拉伯酸、D-甘油酸、2-{[(芐氧基)羰基]氨基}-4-甲基戊酸以及EPA在發(fā)酵第30天含量最高。

酯類是發(fā)酵生成的羧酸和醇的酯化作用的產(chǎn)物，存在于生的、烤的和發(fā)酵食品的揮發(fā)物以及甲殼類魚肉等海鮮中[28]。魚露發(fā)酵過程產(chǎn)生的差異代謝物中脂類有4種，分別為莽草酸酯、乙酸甲酯、壬酸甲酯以及2-氧代-4-甲基戊酸甲酯，這些酯質(zhì)與其他物質(zhì)相互作用，共同構(gòu)成魚露的特殊風(fēng)味。其中乙酸甲酯是國(guó)家規(guī)定食品中可食用的香精，主要呈味為果香。醛類在魚露的風(fēng)味形成中也不可或缺。差異代謝物中的苯乙醛是由苯丙氨酸通過Strecker途徑降解生成，表現(xiàn)出玫瑰花香[29-30]。在魚露的發(fā)酵過程中，苯乙醛的含量不斷升高，說明魚露的香味成分在不斷形成。

魚露的差異代謝物中只檢測(cè)到1種多不飽和脂肪酸，即為EPA，其能預(yù)防老年癡呆癥和抗炎癥，有效降低心血管疾病的發(fā)病率，對(duì)人與動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要作用[31]。由圖3可以看出，EPA的相對(duì)含量在發(fā)酵過程中不斷增加，在發(fā)酵第30天相對(duì)含量較高。魚露中的其他化合物包括呋喃、酮和酚類化合物。呋喃是由美拉德反應(yīng)或氨基酸的熱分解產(chǎn)物產(chǎn)生的，酮類與脂肪酸氧化有關(guān)。

表1 大黃魚魚卵魚露發(fā)酵過程中的顯著差異代謝物Table 1 Significantly differential metabolites in large yellow croaker roe sauce during fermentation

圖3 大黃魚魚卵魚露發(fā)酵過程中差異代謝物層次聚類分析熱圖Fig. 3 Heat map of hierarchical cluster analysis of differential metabolites in large yellow croaker roe sauce during fermentation

2.3 差異代謝物通路分析

KEGG是一個(gè)整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫，通路數(shù)據(jù)庫通過代謝通路濃縮和拓?fù)浞治?，識(shí)別出可能的受發(fā)酵時(shí)間段影響的代謝通路[32]。如圖4、表2所示，根據(jù)代謝通路影響值從大到小的代謝通路分別為纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，蛋白質(zhì)消化吸收，半乳糖代謝，氨酰-tRNA生物合成，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，硫代葡萄糖苷生物合成，三羧酸循環(huán)，氨基酸的生物合成，莽草酸類生物堿的生物合成，磷酸肌醇代謝，不飽和脂肪酸的生物合成。影響值分別為0.130 43、0.106 38、0.086 957、0.076 923、0.06、0.051 948、0.05、0.04 687 5、0.041 667、0.021 277、0.013 514。在所有代謝通路中，氨基酸的生物合成與其他代謝通路存在密切聯(lián)系。

圖4 大黃魚魚卵魚露差異代謝物的代謝通路影響因子圖Fig. 4 Metabolic pathways regulating differential metabolites in large yellow croaker roe sauce

如圖5所示，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成與甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝密切相關(guān)。表現(xiàn)為甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路中所產(chǎn)生的蘇氨酸經(jīng)蘇氨酸脫水酶脫氨脫水形成α-酮丁酸，再和丙酮酸在乙酰乳酸合酶的作用下合成α-乙酰-α-羥丁酸，經(jīng)乙酰乳酸變位酶/還原酶合成α,β-二羥-β-甲基戊酸，接下來經(jīng)二羥酸脫水酶合成α-酮-β-甲基戊酸，結(jié)合谷氨酸在分支鏈氨基酸谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶作用下最終合成異亮氨酸。纈氨酸和亮氨酸的合成首先由丙酮酸脫羧后與另一個(gè)丙酮酸縮合，形成α-乙酰乳酸。然后還原、變位、脫水形成α-酮異戊酸。這是一個(gè)分支點(diǎn)，如果轉(zhuǎn)氨可生成纈氨酸，否則就與乙酰輔酶A縮合，進(jìn)入亮氨酸支路，形成α-酮異己酸再轉(zhuǎn)氨，即生成亮氨酸。

表2 大黃魚魚卵魚露發(fā)酵過程中代謝通路分析表Table 2 Metabolic pathway analysis of large yellow croaker roe sauce during fermentation

圖5 纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成途徑Fig. 5 Biosynthetic pathways of valine leucine and isoleucine

發(fā)酵環(huán)境中的淀粉水解成葡萄糖，通過糖酵解途徑生成丙酮酸。丙酮酸氧化脫羧后生成乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)促進(jìn)琥珀酸等有機(jī)酸的形成，促進(jìn)魚露獨(dú)特風(fēng)味的形成。丙酮酸與糖酵解的中間產(chǎn)物3-磷酸甘油醛縮合生成1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸（1-deoxy-D-xylose 5-phosphate，DXP），乙酰輔酶A生成β-羥基-β-甲基戊二酸單酰輔酶A（β-hydroxyl-β-methylglutaric acid monoacyl coenzyme A，HMG-CoA）。L-半乳糖-1-磷酸酯酶由DXP經(jīng)MEP/DOXP途徑或HMG-CoA經(jīng)甲羥戊酸途徑生成后進(jìn)入萜生物堿類的代謝。

絲氨酸來源于糖酵解的中間體——3-磷酸甘油酸酯，甘氨酸來源于絲氨酸。蘇氨酸是一種動(dòng)物無法合成的必需氨基酸，而在細(xì)菌和植物中，蘇氨酸來源于天冬氨酸。因此魚露中的蘇氨酸主要由發(fā)酵體系中的細(xì)菌以及植物產(chǎn)生。硫代葡萄糖苷生物合成代謝途徑中，原料來源分別為蛋氨酸、芳香族氨基酸、支鏈氨基酸3種。

其次，通過KEGG等權(quán)威代謝物數(shù)據(jù)庫對(duì)差異代謝物進(jìn)行映射，反映出具有極顯著差異的代謝物有15 個(gè)[33]。分別為L(zhǎng)-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-絲氨酸、L-苯丙氨酸、肌醇、α-D-葡萄糖、半乳糖甘油、甘氨酸、DL-蘇氨酸、2-氧代-4-甲基戊酸甲酯、莽草酸酯、琥珀酸、EPA、甘油。從圖6可以直觀比較大黃魚魚卵魚露發(fā)酵過程中15種關(guān)鍵代謝物的相對(duì)含量差異。其中L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-絲氨酸、L-苯丙氨酸參與了蛋白質(zhì)消化吸收，氨酰-tRNA生物合成，氨基酸的生物合成。L-苯丙氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸參與了硫代葡萄糖苷生物合成，甘氨酸、L-絲氨酸和DL-蘇氨酸參與了甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，L-纈氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸參與了纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成。氨基酸類的差異代謝物參與了多條代謝通路，說明氨基酸對(duì)于代謝通路的影響較大，同時(shí)也說明在大黃魚魚卵魚露發(fā)酵過程中，氨基酸的相對(duì)含量變化較大代謝助力了大黃魚魚卵魚露風(fēng)味的形成。琥珀酸主要參與三羧酸循環(huán)和莽草酸類生物堿的生物合成，α-D-葡萄糖主要參與了半乳糖代謝和莽草酸類生物堿的生物合成，肌醇參與了磷酸肌醇代謝，EPA參與了不飽和脂肪酸的生物合成。

圖6 大黃魚魚卵魚露發(fā)酵過程中15種關(guān)鍵代謝物相對(duì)含量箱形圖Fig. 6 Box plots of relative contents of 15 key differential metabolites in large yellow croaker roe sauce during fermentation

3 結(jié) 論

基于GC-TOF-MS建立大黃魚魚卵魚露發(fā)酵過程中不同時(shí)間段的代謝產(chǎn)物的分析方法，用于揭示大黃魚魚卵發(fā)酵過程中形成的差異代謝產(chǎn)物及其代謝通路。以P值不大于0.05且VIP值不小于1為篩選條件得到包括糖類、醇類、氨基酸、酯類、醛類等在內(nèi)的46種差異代謝物。進(jìn)一步對(duì)差異代謝物的代謝通路進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，蛋白質(zhì)消化吸收，半乳糖代謝，氨酰-tRNA生物合成，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，硫代葡萄糖苷生物合成，三羧酸循環(huán)，氨基酸的生物合成，莽草酸類生物堿的生物合成，磷酸肌醇代謝，不飽和脂肪酸的生物合成等11 條關(guān)鍵代謝通路，并且發(fā)現(xiàn)影響代謝通路的15種極顯著差異的代謝物種氨基酸類代謝物參與了多條代謝通路。本方法的建立和代謝產(chǎn)物的分析，為大黃魚魚卵魚露的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論支持，對(duì)于大黃魚魚卵魚露的發(fā)酵過程進(jìn)行質(zhì)量控制有重要意義。