■黃遵錫 王雪艷 程志斌

(1.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650222；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201)

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是革蘭氏陽(yáng)性、硬壁菌門、芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬細(xì)菌，抗逆性好[1-3]，同時(shí)凝結(jié)芽孢桿菌分泌抗菌肽（蛋白）、乳酸等抑菌物質(zhì)[4-6]。因此，飼用凝結(jié)芽孢桿菌作為我國(guó)飼料工業(yè)禁抗形式下的功能性飼用益生菌之一，滿足了顆粒飼料制粒工藝及畜禽良好生產(chǎn)性能的需求[7-8]。大量綜述及動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)表明，畜禽生產(chǎn)性能的改善與飼糧中凝結(jié)芽孢桿菌的添加量有關(guān)[9-13]，因此飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品菌數(shù)檢測(cè)的真實(shí)性和準(zhǔn)確性備受生產(chǎn)企業(yè)及應(yīng)用企業(yè)的關(guān)注。

當(dāng)前，飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品菌數(shù)檢測(cè)的規(guī)范方法為細(xì)菌平板計(jì)數(shù)法（aerobic plate count method），云南省標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)頒布的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《飼料添加劑 凝結(jié)芽孢桿菌的測(cè)定》（T/YNBX 024—2021，簡(jiǎn)稱“云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)”）[14]、北京生物飼料產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟頒布的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《飼料添加劑 凝結(jié)芽孢桿菌》（T/CSWSL 022—2020，簡(jiǎn)稱“北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)”）[15]及遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)《飼用微生物制劑中凝結(jié)芽孢桿菌的檢測(cè)》（DB21/T 3278—2020）[16]均采用該方法。對(duì)比以上三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中的檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)不同標(biāo)準(zhǔn)之間對(duì)飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)檢測(cè)的基本概念及具體的操作步驟存在明顯差異。據(jù)此，本文詳述了檢測(cè)的操作差異及其對(duì)菌數(shù)檢測(cè)結(jié)果的影響，為科學(xué)、準(zhǔn)確地檢測(cè)飼用凝結(jié)芽孢桿菌的菌數(shù)提供參考。

1 飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品及其菌數(shù)檢測(cè)的基本概念

與其他芽孢桿菌屬飼用益生菌一樣，工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的凝結(jié)芽孢桿菌原粉中主要包括芽孢化的凝結(jié)芽孢桿菌（簡(jiǎn)稱“芽孢”）及少量未芽孢化的凝結(jié)芽孢桿菌活菌（簡(jiǎn)稱“活菌”）。依據(jù)生產(chǎn)應(yīng)用的需求，將凝結(jié)芽孢桿菌原粉添加一定比例的載體或（和）其他商業(yè)飼用益生菌，最終形成飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品。借鑒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《微生物飼料添加劑通用要求》（GB/T 23181—2008）[17]對(duì)微生物飼料添加劑的規(guī)范描述，本文定義了飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品的兩種類型：①單一飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品（Bacillus coagulansfeed additive）：產(chǎn)品中的唯一“功能菌”（functional microorganism）是凝結(jié)芽孢桿菌；②復(fù)合飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品（mixed feed additive ofBacillus coagulansand other probiotics）：多個(gè)功能菌組合的產(chǎn)品，且凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)占比大于1%。這一指標(biāo)基于GB/T 23181—2018[17]對(duì)產(chǎn)品“雜菌”（nontarget microorganisms）的描述，有助于兩種類型飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品的標(biāo)識(shí)及質(zhì)量檢測(cè)。

當(dāng)前，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)均采用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)飼用凝結(jié)芽孢桿菌的菌數(shù)，其檢測(cè)原理是將待檢樣品和（或）盲樣中的功能菌接種到特定瓊脂培養(yǎng)基上，一定時(shí)間內(nèi)單個(gè)菌體細(xì)胞在培養(yǎng)基上長(zhǎng)成肉眼可見的菌，通過特征菌落的辨識(shí)及菌落計(jì)數(shù)（CFU/g），定量產(chǎn)品中的凝結(jié)芽孢桿菌及可能的其他菌[18]。鑒于待檢樣品或盲樣可能是單一或復(fù)合飼用凝結(jié)芽孢桿菌，且產(chǎn)品的功能菌存在芽孢和活菌等多種形式，再加上載體及稀釋工藝可能污染的雜菌，因此飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品菌數(shù)的檢測(cè)應(yīng)包括3個(gè)指標(biāo)：①芽孢數(shù)（spore count）：產(chǎn)品中以芽孢形式存在的凝結(jié)芽孢桿菌；②總菌數(shù)（total aerobic count）：產(chǎn)品中凝結(jié)芽孢桿菌的芽孢和活菌的總數(shù)；③雜菌數(shù)（nontarget microorganism count）：產(chǎn)品中占比小于1%的非功能菌。據(jù)此，飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品“芽孢率”的計(jì)算基于芽孢數(shù)除以總菌數(shù)的百分比；飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品“雜菌率”的計(jì)算基于雜菌數(shù)除以總菌數(shù)與雜菌數(shù)之和的百分比。

由于發(fā)酵生產(chǎn)的凝結(jié)芽孢桿菌原粉及稀釋的飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品包含凝結(jié)芽孢桿菌的芽孢和活菌，因此凝結(jié)芽孢桿菌生產(chǎn)企業(yè)一般只標(biāo)識(shí)產(chǎn)品的總菌數(shù)。然而，除蛋雞粉料無需制粒加工外，飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品在大部分顆粒料中的耐熱性評(píng)估，是指制粒后顆粒料中凝結(jié)芽孢桿菌的有效芽孢數(shù)及存留率[19-20]。因此，飼用凝結(jié)芽孢桿菌的芽孢數(shù)更受到飼料生產(chǎn)及養(yǎng)殖應(yīng)用企業(yè)的關(guān)注。此外，產(chǎn)品雜菌及雜菌率嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量及應(yīng)用效果，飼用凝結(jié)芽孢桿菌生產(chǎn)企業(yè)、應(yīng)用企業(yè)均需嚴(yán)格把控雜菌的檢測(cè)。

2 平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的概述

圖1 和圖2 分別描述了云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)、北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品總菌數(shù)、芽孢數(shù)及雜菌數(shù)的檢測(cè)。由于遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)DB21/T 3728—2020與北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)程序與操作相同，本文后續(xù)重點(diǎn)比較云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)、北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)對(duì)飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)檢測(cè)的差異。

兩個(gè)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中相似的基本檢測(cè)程序，包括：取樣、樣品菌懸液制備、梯度稀釋、接種、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)（見圖1 和圖2）。然而，與云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)相比，北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)多了樣品“菌懸液熱處理”步驟（見圖2）。熱處理操作參數(shù)為80 ℃水浴10 min，與標(biāo)準(zhǔn)《飼料中飼用芽孢桿菌的測(cè)定》（DB32/T 2583—2013）[21]的芽孢數(shù)檢測(cè)參數(shù)一致。由于熱處理已殺滅活菌，因此北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)的是飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品的芽孢數(shù)（見圖2），同時(shí)已無法計(jì)數(shù)產(chǎn)品的總菌數(shù)及計(jì)算產(chǎn)品的芽孢率。進(jìn)一步分析圖1，未采用熱處理操作的云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)的是產(chǎn)品中凝結(jié)芽孢桿菌的總菌數(shù)（包括芽孢和活菌）。誠(chéng)然，云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)不能定量飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品的芽孢數(shù)及芽孢率。

圖1 云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)（T/YNBX 024—2021）中飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的檢測(cè)程序

圖2 北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)（T/CSWSL 022—2020）中飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的檢測(cè)程序

此外，就產(chǎn)品雜菌檢測(cè)而言，盡管云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了雜菌檢測(cè)的描述（見圖1），但認(rèn)為無法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。主要原因包括：其一，缺失雜菌菌落識(shí)別步驟。雜菌的定義是產(chǎn)品中占比小于1%的非功能菌，檢測(cè)操作中應(yīng)強(qiáng)調(diào)雜菌菌落形態(tài)的觀察及識(shí)別，但云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)未詳細(xì)描述，建議借鑒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)用微生物菌劑》（GB 20287—2006）[17]中操作步驟“6.3.2.3 菌落識(shí)別”進(jìn)行完善。其二，雜菌的培養(yǎng)基應(yīng)用失誤。受發(fā)酵工藝、產(chǎn)品設(shè)計(jì)及加工過程等諸多因素影響，產(chǎn)品中的雜菌可能復(fù)雜、多樣。依據(jù)云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)描述的雜菌檢測(cè)程序中操作步驟“6.4.2 培養(yǎng)基”，雜菌的檢測(cè)培養(yǎng)基與總菌數(shù)的檢測(cè)培養(yǎng)基完全相同顯然不可行。誠(chéng)然，基于平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)飼用益生菌產(chǎn)品中的雜菌一直是個(gè)難題。在識(shí)別雜菌菌落形態(tài)的基礎(chǔ)上，借鑒標(biāo)準(zhǔn)《水產(chǎn)微生態(tài)制劑 解淀粉芽孢桿菌生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》（DB12/T 863—2019）[23]操作步驟“6.4 雜菌率的測(cè)定”中雜菌分類檢測(cè)（如好氧雜菌、厭氧雜菌）的思路，可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)方法的完善。

3 平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的操作差異

盡管兩個(gè)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)檢測(cè)的檢測(cè)程序相似（包括取樣、樣品菌懸液制備、梯度稀釋、接種、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)等）。然而，具體的操作存在差異，分析見表1。

表1 兩個(gè)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)在飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)檢測(cè)中的操作差異

3.1 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)底物（培養(yǎng)基組分及含量）及環(huán)境pH（液體培養(yǎng)基pH）是細(xì)菌正常生長(zhǎng)的重要條件[24-25]，因此選用培養(yǎng)基對(duì)檢測(cè)凝結(jié)芽孢桿菌十分關(guān)鍵。就凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)的瓊脂培養(yǎng)基而言，云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)與北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)有一定差異。

3.1.1 培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)組分及含量差異

云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)與北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)的瓊脂培養(yǎng)基共有營(yíng)養(yǎng)組分包括蛋白胨、半胱氨酸鹽酸鹽、酵母膏（粉）、葡萄糖、硫酸錳、瓊脂。已有文獻(xiàn)顯示，這些營(yíng)養(yǎng)組分是凝結(jié)芽孢桿菌增生、增殖的重要氮源、碳源及礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，適合凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)[26-29]。此外，云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基特有成分，包括番茄粉、牛肉膏、氯化鈉、無水氯化鈣。番茄粉常用于嗜酸性細(xì)菌培養(yǎng)基，能夠顯著促進(jìn)乳酸菌類細(xì)胞的增生、增殖[25]；牛肉膏的應(yīng)用是在蛋白胨基礎(chǔ)上進(jìn)一步增強(qiáng)凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)所需的氮源。因此，云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基強(qiáng)化了細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求。

北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基特有成分包括溴甲酚紫、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂。與云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)相比，北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)培養(yǎng)基強(qiáng)化了凝結(jié)芽孢桿菌生長(zhǎng)所需的礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)。更重要的是，鑒于溴甲酚紫在酸性條件顯示黃色、堿性環(huán)境下顯示紫色[25，27]，顯然北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)傾向于采用凝結(jié)芽孢桿菌的“選擇性培養(yǎng)基”，以便通過顯色增強(qiáng)凝結(jié)芽孢桿菌特征菌落的辨識(shí)及計(jì)數(shù)，并區(qū)別待檢樣品中的雜菌及可能的其他功能菌。這無疑提高了盲檢樣品的準(zhǔn)確性，也方便檢測(cè)人員的操作，尤其是對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)熟悉度不高的檢測(cè)人員[27]。

另外，進(jìn)一步對(duì)比培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)組分的含量，云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的營(yíng)養(yǎng)組分占比為4.19%，北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的營(yíng)養(yǎng)組分占比為1.56%，有明顯差異。

3.1.2 培養(yǎng)基初始pH的可能差異

大量試驗(yàn)研究及綜述報(bào)道顯示，中性偏酸環(huán)境（pH 5.5～6.5）是凝結(jié)芽孢桿菌適合的生長(zhǎng)條件[1，6，27-28]?；谏鲜鰞蓚€(gè)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)組分及含量差異，尤其是番茄粉等特有成分的使用，筆者推測(cè)：云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基初始pH低于北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，更適合凝結(jié)芽孢桿菌的生長(zhǎng)及培養(yǎng)，有利于菌數(shù)檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

3.1.3 培養(yǎng)基調(diào)整pH的差異

基于培養(yǎng)基初始pH可能影響凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)檢測(cè)的準(zhǔn)確性，兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)均對(duì)培養(yǎng)基pH進(jìn)行了調(diào)整，云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整的培養(yǎng)基pH為5.2，北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整的培養(yǎng)基pH 為5.5。盡管調(diào)整后的pH 相近，但結(jié)合培養(yǎng)基差異化的營(yíng)養(yǎng)組分及含量，其是否影響飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的檢測(cè)有待于進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

3.2 稀釋液

檢測(cè)程序中提前準(zhǔn)備的稀釋液（見圖1 和圖2），用于制備樣品菌懸液及梯度稀釋操作。稀釋液的主要功效是盡可能地保障菌懸液中凝結(jié)芽孢桿菌的分散程度，實(shí)現(xiàn)平板上呈現(xiàn)分散清晰的菌落，以便菌落計(jì)數(shù)。與北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)相比，云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的稀釋液增加了“吐溫-80（聚山梨醇酯-80）”。吐溫-80 是一種非離子型表面活性劑，作為一種高效分散劑常用于細(xì)菌檢測(cè)，有利于菌數(shù)檢測(cè)的準(zhǔn)確性[30]。顯然，云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)化了凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)中稀釋液的功效。

3.3 檢測(cè)操作

3.3.1 取樣差異

北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的取樣操作為將25 g 樣品加入225 mL 稀釋液中，樣品稀釋10%，這與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測(cè)》（GB/T 26428—2020）[31]一致。云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)為將1 g樣品加入100 mL 稀釋液中，稀釋了1%。顯然，兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的取樣操作具有一定差異?；趯?shí)際生產(chǎn)與應(yīng)用中往往對(duì)樣品（高菌數(shù)的凝結(jié)芽孢桿菌原粉、低菌數(shù)的飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品）進(jìn)行盲檢，取樣方式的差異顯然會(huì)影響后續(xù)檢測(cè)步驟“菌懸液的梯度稀釋”。

3.3.2 樣品菌懸液制備（均質(zhì)）差異

兩個(gè)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的樣品菌懸液制備，均采用了搖床均質(zhì)法。均質(zhì)是細(xì)菌菌數(shù)檢測(cè)過程中的重要步驟之一，目的是將樣品與稀釋液充分混合，制備樣品菌懸液。搖床規(guī)律振蕩促使樣品中的細(xì)菌在稀釋液中分散均勻，起到均質(zhì)作用[32]。云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中搖床振蕩參數(shù)為220 r/min、振蕩30 min，北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中搖床振蕩參數(shù)為185 r/min、振蕩60 min。涂家霖等[32]研究顯示，搖床轉(zhuǎn)速顯著影響凝結(jié)芽孢桿菌的生長(zhǎng)。云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)采用“高速、短時(shí)”搖床均質(zhì)，北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)采用“低速、長(zhǎng)時(shí)”搖床均質(zhì)，這一差異對(duì)飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)檢測(cè)的影響有待評(píng)估。

此外，也有借助設(shè)備無菌均質(zhì)器、均質(zhì)樣品檢測(cè)凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)的報(bào)道[33]。通過無菌均質(zhì)器的拍打?qū)崿F(xiàn)樣品菌懸液的均質(zhì)，拍打頻率為3～12 次/s，時(shí)間為1～10 min。

3.3.3 菌懸液熱處理差異

云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)無菌懸液熱處理操作，北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)多了菌懸液熱處理操作，即80 ℃水浴處理10 min，這是兩個(gè)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)之間最大的差異。鑒于盲檢樣品含有凝結(jié)芽孢桿菌的芽孢和活菌、可能的雜菌以及其他功能菌（復(fù)合益生菌產(chǎn)品），筆者對(duì)菌懸液熱處理操作的觀點(diǎn)如下：其一，若樣品中只含單一凝結(jié)芽孢桿菌，菌懸液熱處理后實(shí)測(cè)的是凝結(jié)芽孢桿菌的芽孢數(shù)，而不是總菌數(shù)；其二，若樣品中含高比例雜菌，且雜菌不耐熱（如大腸桿菌、酵母菌），熱處理操作可能誤判樣品雜菌及雜菌率。據(jù)此，若采用北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)判定飼用凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)品的質(zhì)量，雜菌判定可能存在誤判的風(fēng)險(xiǎn)，這恰恰是飼料及養(yǎng)殖應(yīng)用企業(yè)需要警惕的關(guān)鍵。

3.3.4 接種操作差異

涂布法（spread plate method）和傾注法（pour plate method）是細(xì)菌檢測(cè)的常用接種操作法，均為了實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞在固體培養(yǎng)基上形成肉眼可見的清晰菌落，以便后續(xù)平板計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性[34-36]。云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的接種法為傾注法，而北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的接種法為涂布法。

涂布法和傾注法在飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)檢測(cè)中各有優(yōu)缺點(diǎn)。涂布法的優(yōu)點(diǎn)是菌落生長(zhǎng)在培養(yǎng)基表面，易觀察計(jì)數(shù)；且操作簡(jiǎn)單，對(duì)檢測(cè)人員的熟練度要求不高。涂布法的缺點(diǎn)是需要借助涂布器操作，涂布器在操作過程中會(huì)不可避免地粘連少量待檢細(xì)菌，理論上造成檢測(cè)值低于真實(shí)值[34]。相反，傾注法將稀釋菌液直接倒入培養(yǎng)基，避免了涂布器粘連的問題。因此，理論上傾注法較涂布法的檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確[35]。然而，傾注法的缺點(diǎn)是對(duì)檢測(cè)人員操作熟練度的要求較高，因?yàn)閮A注法導(dǎo)致大量菌體鑲嵌在培養(yǎng)基內(nèi)，增加了菌落辨識(shí)與計(jì)數(shù)的難度[36]。據(jù)此，建議根據(jù)實(shí)際操作情況選用適合的接種法。

3.3.5 培養(yǎng)差異

培養(yǎng)操作的關(guān)鍵是培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時(shí)間，且兩者相關(guān)性較強(qiáng)。眾所周知，溫度是細(xì)菌增殖、增生的重要條件之一[24-25]。大量研究與綜述顯示，凝結(jié)芽孢桿菌在35～50 ℃環(huán)境溫度中均能生長(zhǎng)[1，27-28，37]。然而，就凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)的培養(yǎng)條件而言，溫度范圍過于寬泛，不利于檢測(cè)的準(zhǔn)確性。這一問題也反映在現(xiàn)有的兩個(gè)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中。云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)溫度為40 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為48 h；北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)溫度為50 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為24 h，存在較大差異。

當(dāng)前，有關(guān)培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時(shí)間對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)菌數(shù)影響的試驗(yàn)研究較少，且報(bào)道結(jié)果存在差異。單春?jiǎn)痰萚27]以平板觀察到的菌落數(shù)量、大小、分散程度等為指標(biāo)，研究了多個(gè)培養(yǎng)溫度（37、42、45、50 ℃）及培養(yǎng)時(shí)間（24、36 h）對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)檢測(cè)結(jié)果的影響，研究顯示凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)檢測(cè)的最佳培養(yǎng)溫度為50 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為24 h。徐麗等[38]描述的飼用凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)培養(yǎng)溫度為45～50 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為24～48 h。薛志清等[39]專利文獻(xiàn)中飼用凝結(jié)芽孢桿菌檢測(cè)培養(yǎng)溫度為45～55 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為22～26 h。以上分析提示，飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)檢測(cè)的適合培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時(shí)間值得進(jìn)一步試驗(yàn)確定。

4 小結(jié)

綜上所述，當(dāng)前云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)和北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)檢測(cè)的程序與操作存在諸多差異，造成云南團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)側(cè)重產(chǎn)品的總菌數(shù)，北京團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)側(cè)重產(chǎn)品的芽孢數(shù)，且兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)均無法準(zhǔn)確檢測(cè)雜菌數(shù)。本綜述以期為現(xiàn)有飼用凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的更新及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)。