黃克智 李益清 謝少凡 肖潔 楊文娟 謝雙鋒 馬麗萍 聶大年

造血干細(xì)胞移植是有望治愈急性白血病、遺傳代謝性疾病等的有效手段[1-3]。隨著移植技術(shù)的進(jìn)步，單倍體造血干細(xì)胞移植正成為主要移植方式之一[4-6]。植入失敗是單倍體造血干細(xì)胞移植少見、嚴(yán)重甚至致命的并發(fā)癥[7-8]。二次移植是治療植入失敗的公認(rèn)有效策略，然而，植入失敗的原因、二次移植的供者選擇、預(yù)處理方案等仍有待進(jìn)一步研究。本研究報(bào)道了2 例急性白血病單倍體造血干細(xì)胞移植植入失敗的患者，采用二次移植成功治療植入失敗，受者獲得良好生存，報(bào)道如下。

1 臨床資料

例1，男，42 歲。2018年8月因“頭暈、心悸”入院，當(dāng)?shù)夭橥庵苎准?xì)胞4.02×109/L，紅細(xì)胞1.30×1012/L，血紅蛋白40 g/L，血小板21×109/L，骨髓細(xì)胞學(xué)檢查考慮骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS），地中海貧血基因檢測(cè)提示41-42 位點(diǎn)雜合突變的β 地中海貧血。予地西他濱（decitabine）+阿糖胞苷（cytarabine）+阿克拉霉素（aclacinomycin）+粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）化學(xué)藥物治療（化療），化療第10日轉(zhuǎn)至中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，最終診斷為“急性髓系白血?。沪?地中海貧血”，予以4 次化療（圖1）。

患者于2019年3月進(jìn)行首次單倍體造血干細(xì)胞移植，供者為次子，19 歲，人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）7/10 相合，供者和受者血型分別為O 型和A 型，供者伴β 地中海貧血。供者外周血紅細(xì)胞6.03×1012/L，血紅蛋白115 g/L，紅細(xì)胞平均體積63.3 fl，紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量19.1 pg，紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度301 g/L，呈小細(xì)胞低色素性貧血。受者的供者特異性抗體（donor specific antibody，DSA）陰性。預(yù)處理采用白消安（busulfan，Bu）+環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，Cy）+抗胸腺細(xì)胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）方案，供者外周血干細(xì)胞（peripheral blood stem cell，PBSC）動(dòng)員采用G-CSF，受者移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）預(yù)防采用環(huán)孢素（ciclosporin，CsA）+ 嗎替麥考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）+短程甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）（圖1）。由于PBSC 采集不理想，在供者動(dòng)員第4～6日，共進(jìn)行了3 次PBSC 采集，共獲得有核細(xì)胞7.84×108/kg、單個(gè)核細(xì)胞7.38×108/kg，CD34+細(xì)胞2.57×106/kg。+15 d 中性粒細(xì)胞、血小板植入。

+82 d，患者外周血白細(xì)胞0.51×109/L，中性粒細(xì)胞0.26×109/L，血紅蛋白59 g/L，血小板11×109/L，骨髓微小殘留病灶陰性，短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR）檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞59%為供者型，考慮繼發(fā)植入失敗。予以減停免疫抑制藥、刺激造血，并采用阿托伐他汀、乙酰半胱氨酸促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)等措施，+97 d 輸注臍帶血（男，HLA 5/6 相合，血型O 型，有核細(xì)胞2.67×107/kg，CD34+細(xì)胞1.42×105/kg）、間充質(zhì)干細(xì)胞1×107個(gè)，+100 d 輸注供者（次子）動(dòng)員后的PBSC，含單個(gè)核細(xì)胞2.1×108/kg，CD34+細(xì)胞0.72×106/kg。+114 d 骨髓微小殘留病灶陰性，STR 檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞0%為次子供者型，24.93%為臍帶血供者型。+117 d患者高熱，血培養(yǎng)肺炎克雷伯菌陽(yáng)性，降鈣素原48.57 ng/mL。在此期間患者外周血白細(xì)胞（0.11～0.35）×109/L，血紅蛋白53～73 g/L，血小板（5～32）×109/L，繼續(xù)予支持對(duì)癥治療。

2019年8月行二次移植（+146 d），供者為長(zhǎng)子，23 歲，HLA 7/10 相合，供者和受者血型分別為O 型和A 型，供者血常規(guī)、骨髓形態(tài)、染色體無(wú)異常，受者DSA 陰性。預(yù)處理采用減低劑量氟達(dá)拉濱（fludarabine，F(xiàn)lu）+Bu+ATG 方案（圖1）。輸注第二供者PBSC，含有核細(xì)胞16.24×108/kg，單個(gè)核細(xì)胞10.94×108/kg，CD34+細(xì)胞4.28×106/kg。二次移植+10 d 血小板植入，+12 d 中性粒細(xì)胞植入。多次隨訪（末次隨訪時(shí)間為二次移植+1 062 d）血常規(guī)基本正常，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)提示白血病完全緩解，微小殘留病灶陰性，STR 檢測(cè)結(jié)果提示細(xì)胞100%為長(zhǎng)子供者型，期間曾有肺部、軟組織感染，治療后好轉(zhuǎn)，無(wú)GVHD 等并發(fā)癥。

圖1 例1 患者治療全過(guò)程Figure 1 Treatment procedure of patient 1

例2，男，15 歲。2021年5月因“腹痛12日，發(fā)熱2日”就診于中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，外周血白細(xì)胞58.97×109/L，紅細(xì)胞2.69×1012/L，血紅蛋白84 g/L，血小板93×109/L，最終診斷為急性淋巴細(xì)胞白血病，予以5 次化療（圖2）。期間伴肺部真菌感染，使用三唑類抗真菌治療。

2021年10月行首次單倍體造血干細(xì)胞移植，供者為胞姐，23 歲，HLA 8/10 相合，地中海貧血SEA 基因雜合缺失，供者和受者血型分別為A 型和AB 型。供者外周血紅細(xì)胞5.50×1012/L，血紅蛋白122 g/L，紅細(xì)胞平均體積71.6 fl，紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量22.2 pg，紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度310 g/L，呈小細(xì)胞低色素性貧血。受者DSA 陰性。預(yù)處理方案為Bu+Flu，GVHD 預(yù)防采用環(huán)孢素+嗎替麥考酚酯+移植后Cy（post-transplant Cy，PTCy ）（圖2）。兩日內(nèi)共輸注PBSC 含有核細(xì)胞26.36×108/kg，單個(gè)核細(xì)胞10.19×108/kg，CD34+細(xì)胞1.99×106/kg。+13 d 中性粒細(xì)胞、血小板植入。+18 d 開始患者出現(xiàn)血象三系進(jìn)行性下降，+24 d 骨髓增生減低，微小殘留病灶陰性，STR 檢測(cè)結(jié)果提示細(xì)胞84%為供者型，予刺激造血、改善造血微環(huán)境等處理后，血象無(wú)好轉(zhuǎn)，三系進(jìn)一步下降，需要依賴血制品輸注。+30 d血白細(xì)胞0.16×109/L，中性粒細(xì)胞0.02×109/L，血紅蛋白69 g/L，血小板14×109/L，考慮植入失敗。

2021年11月行二次移植（首次單倍體造血干細(xì)胞移植+39～40 d），供者為胞妹，12歲，HLA 5/10相合，供受者血型均為AB 型，供者血常規(guī)正常。預(yù)處理方案為Flu+Bu+ATG（圖2）。輸注第二供者PBSC，含有核細(xì)胞33.9×108/kg，單個(gè)核細(xì)胞17.46×108/kg，CD34+細(xì)胞5.75×106/kg。二次移植+10 d 中性粒細(xì)胞、血小板植入。多次隨訪（末次隨訪時(shí)間為二次移植+265 d）血白細(xì)胞（2.36～6.46）×109/L，血紅蛋白、血小板基本正常，骨髓微小殘留病灶陰性，STR 檢測(cè)結(jié)果提示細(xì)胞100%為第二供者型。期間曾有輕度血轉(zhuǎn)氨酶升高、輕度慢性GVHD（皮膚、肺），治療后好轉(zhuǎn)。

圖2 例2 患者治療全過(guò)程Figure 2 Treatment procedure of patient 2

2 討論

當(dāng)前，單倍體造血干細(xì)胞移植治療急性白血病的例數(shù)日益增多[9-10]，植入失敗等并發(fā)癥亦需重視[11-16]。本文分析2 例急性白血病單倍體造血干細(xì)胞移植植入失敗，發(fā)現(xiàn)2 例供者均伴有地中海貧血，導(dǎo)致PBSC采集困難，CD34+細(xì)胞數(shù)量偏少，是植入失敗的重要原因。重要的是，2 例植入失敗患者均及時(shí)進(jìn)行二次移植，移植物成功植入，患者獲得良好生存。

2.1 植入失敗的原因

按照歐洲骨髓移植協(xié)會(huì)（European Society for Blood and Marrow Transplantation，EBMT） 植入標(biāo)準(zhǔn)[17]，連續(xù)3 d 中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)＞0.5×109/L 為粒細(xì)胞植入；連續(xù)7 d 不輸注血小板，血小板≥20×109/L為血小板植入。原發(fā)性植入失敗為骨髓或外周造血干細(xì)胞移植+28 d，中性粒細(xì)胞、血小板未達(dá)植入標(biāo)準(zhǔn)；繼發(fā)性植入失敗為植入成功后，再次出現(xiàn)三系或兩系血細(xì)胞下降或供受者嵌合狀態(tài)＜5%，并排除疾病復(fù)發(fā)、感染、藥物等因素[18]。

最近，Man 等[19]提出了移植物功能不良的“種子-土壤-害蟲”理論學(xué)說(shuō)。作為“種子”的CD34+細(xì)胞，很多移植中心通常要求最低限度是2.0×106/kg，而EBMT 則推薦5.0×106/kg 是更優(yōu)的劑量。據(jù)報(bào)道，CD34+細(xì)胞＜3.0×106/kg，植入失敗率可達(dá)12%[20]。本研究中2 例植入失敗患者首次移植的CD34+細(xì)胞分別為2.57×106/kg 和1.99×106/kg，均偏少，是植入失敗的重要因素。究其原因，2 例供者均伴有地中海貧血，PBSC 總采集天數(shù)分別為3 d、2 d，最終總CD34+細(xì)胞數(shù)量仍偏少。伴地中海貧血的供者是否符合移植要求，目前未有定論。據(jù)報(bào)道，供者伴地中海貧血確實(shí)會(huì)影響PBSC 采集，但通過(guò)調(diào)整采集參數(shù)、增加采集次數(shù)，仍然可以收獲足量PBSC，并成功植入，不影響造血重建[21-24]。

地中海貧血對(duì)干細(xì)胞采集的影響與血細(xì)胞分離機(jī)工作原理有關(guān)。目前常用的血細(xì)胞分離機(jī)屬于連續(xù)流動(dòng)離心式設(shè)備，根據(jù)血液各成分的不同比重進(jìn)行分離，離心后血液各成分密度從小至大分別是血漿、血小板、白細(xì)胞和紅細(xì)胞，干細(xì)胞密度接近白細(xì)胞中的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞。Sanford 等[22]指出，地中海貧血供者平均紅細(xì)胞體積、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度減小，紅細(xì)胞密度減小，與干細(xì)胞密度差值縮小（紅細(xì)胞密度甚至低于干細(xì)胞），因此干細(xì)胞更容易沉積在紅細(xì)胞層，導(dǎo)致原本在正常吸取干細(xì)胞層的位置吸取不到足量的干細(xì)胞。這種情況下，建議調(diào)整機(jī)器參數(shù)在更深（密度更大）的位置吸取干細(xì)胞。另外，地中海貧血供者紅細(xì)胞大小分布和密度范圍相對(duì)更廣、更不均勻，離心過(guò)程不能形成堅(jiān)固的支撐層，不能形成有效的屏障支撐干細(xì)胞，因此建議加大離心速度。我們對(duì)2 例伴地中海貧血供者的PBSC 采集參數(shù)也進(jìn)行了調(diào)整，但未能取得理想效果。地中海貧血者紅細(xì)胞血紅蛋白量減少，密度降低，使得低密度的干細(xì)胞更容易沉積至紅細(xì)胞層，降低干細(xì)胞采集率。為提高采集率，參數(shù)調(diào)整包括下移干細(xì)胞采集層位置，加大離心速度等[22]。

除了CD34+細(xì)胞數(shù)量偏低，骨髓造血微環(huán)境受破壞、DSA 陽(yáng)性、移植前疾病未緩解、病毒感染、多次輸血、GVHD 等均是植入失敗的重要因素[14,18-19,25-27]。

2.2 二次移植治療植入失敗

植入失敗的治療措施包括停用毒性藥物（如環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤等）、調(diào)整免疫抑制藥、應(yīng)用造血刺激因子、備存的自體干細(xì)胞解救、間充質(zhì)干細(xì)胞輸注、供者淋巴細(xì)胞輸注、二次移植等[18,28]，其中二次移植是公認(rèn)的有效手段。

在采取了多種措施無(wú)效后，我們對(duì)植入失敗患者進(jìn)行了二次移植。在供者選擇上，二次移植可采用首次移植的供者，或者合適的其他供者[9]?？紤]到首次移植的供者伴有地中海貧血，采集的PBSC 數(shù)量偏少，筆者中心選擇了另外的單倍體供者。預(yù)處理方案采用了非清髓性的Flu+Bu+ATG 方案，理由包括：（1）經(jīng)過(guò)首次移植預(yù)處理對(duì)骨髓造血微環(huán)境的損傷，若再次使用清髓性預(yù)處理可能會(huì)加重機(jī)體創(chuàng)傷，對(duì)后續(xù)移植物歸巢、植入、分化等產(chǎn)生負(fù)面影響；（2）結(jié)合既往文獻(xiàn)資料，二次移植多采用Flu 或ATG 為基礎(chǔ)的減低強(qiáng)度預(yù)處理[29-31]，效果良好。Nagler 等[32]采用Flu+Bu+ATG 減低強(qiáng)度預(yù)處理行二次移植，治療11 例首次移植后復(fù)發(fā)或繼發(fā)其他腫瘤的惡性血液病，移植物均成功植入，生存率較高且無(wú)明顯并發(fā)癥。筆者認(rèn)為，F(xiàn)lu 和ATG 的強(qiáng)效免疫抑制作用，使受者T 淋巴細(xì)胞對(duì)供者造血干細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受，有利于干細(xì)胞植入。結(jié)果顯示，2 例患者均對(duì)二次移植的Flu+Bu+ATG 預(yù)處理耐受性良好，+10 d 血小板植入，+10～12 d 中性粒細(xì)胞植入。

目前，二次移植治療首次移植植入失敗的報(bào)道不多，尤其是二次移植均采用單倍體供者并獲得成功則更為少見。顧斌等[33]對(duì)1 例急性髓系白血病單倍體造血干細(xì)胞移植（供者為父親）原發(fā)植入失敗采用了二次移植（供者為胞姐），未能成功植入，患者8 個(gè)月后死于肺部感染。張競(jìng)文等[34]對(duì)1 例急性淋巴細(xì)胞白血病單倍體造血干細(xì)胞移植（供者為胞妹）植入失敗后進(jìn)行了二次移植（供者為父親），二次移植前沒(méi)有預(yù)處理化療，而采用PTCy 為基礎(chǔ)的方案預(yù)防GVHD。+12 d 中性粒細(xì)胞植入，+67 d 血小板植入，移植后臨床狀況改善，但一年半后患者死于白血病復(fù)發(fā)。Giammarco 等[35]對(duì)19 例單倍體造血干細(xì)胞移植植入失敗的患者進(jìn)行了二次移植，其中13 例采用首次移植的供者，6 例更換為新供者。結(jié)果顯示，74%的患者獲得了三系重建，一年生存率66%。多因素分析提示，Bu減量可能是原發(fā)植入失敗的高危因素。另有6 例急性白血病兒童，原發(fā)植入失敗后進(jìn)行了二次移植，均采用Flu+ATG 為基礎(chǔ)的預(yù)處理方案。其中1例早期死亡，5例中性粒細(xì)胞和血小板均成功植入。中位隨訪時(shí)間6.8年，4 例存活者仍處于疾病緩解狀態(tài)[31]。

與上述研究相比，本研究的2 例二次移植均成功植入，并獲得良好生存。既往筆者中心也曾對(duì)1 例慢性粒細(xì)胞白血病移植后植入失敗進(jìn)行了二次移植，受者獲得了長(zhǎng)期生存[36]。筆者中心的經(jīng)驗(yàn)表明，在充分優(yōu)化預(yù)處理方案、供者選擇等移植流程時(shí)，二次移植治療植入失敗是有效、安全的。

但是，本研究仍存在不足：首先是2 例患者首次移植時(shí)，供者均伴有地中海貧血，雖經(jīng)過(guò)充分溝通，患方仍堅(jiān)持選擇地中海貧血供者，導(dǎo)致PBSC 采集困難，即使調(diào)整了采集參數(shù)，獲取的CD34+細(xì)胞數(shù)量仍偏少，一定程度上誘發(fā)了植入失??；其次是二次移植例數(shù)僅有2 例，隨訪時(shí)間仍相對(duì)較短。今后筆者將在供者選擇、干細(xì)胞采集流程進(jìn)一步優(yōu)化，并繼續(xù)對(duì)二次移植受者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，同時(shí)增加觀察例數(shù)。

綜上所述，減低劑量預(yù)處理的二次移植能夠成功治療急性白血病首次單倍體造血干細(xì)胞移植植入失敗。