呂新 劉蘭英 李玥仁

摘 要：為探索大腸桿菌DH5a高效電擊轉(zhuǎn)化條件，通過對電擊轉(zhuǎn)化條件中細(xì)胞生長狀態(tài)、DNA加入量、感受態(tài)細(xì)胞體積、電場強(qiáng)度、速凍和恢復(fù)時(shí)間等關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，篩選出大腸桿菌DH5a高效電擊轉(zhuǎn)化條件。結(jié)果表明：大腸桿菌在細(xì)胞生長狀態(tài)OD600值為0.6時(shí)制備感受態(tài)細(xì)胞，按每管50 μL體積分裝、-80℃乙醇速凍后，加入10 pg pUC 19質(zhì)粒DNA，在20 kv·cm-1電場強(qiáng)度、電容25 μF、電阻200 Ω條件下電擊轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后恢復(fù)培養(yǎng)60 min，轉(zhuǎn)化效率達(dá)1010 cfu·μg-1 DNA以上水平，可滿足基因文庫構(gòu)建、抗體庫篩選等試驗(yàn)需求。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌;DH5a菌株; 高效；電擊轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)：Q 939.9? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ?文章編號(hào)：0253-2301（2023）02-0008-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.02.002

Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China; 2. Fujian Key Laboratory

of Agroproducts Quality & Safety， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： In order to explore the conditions of highefficiency electroporation transformation for Escherichia coli DH5a， the key factors in the conditions of electroporation transformation such as the cell growth state， the adding quantity of DNA， the volume of competent cells， electric field intensity， quick freezing and recovery time were optimized， thus to screen the conditions of highefficiency electroporation transformation for Escherichia coli DH5a. The results showed that： the competent cells of Escherichia coli were prepared when the OD600 value of the cell growth state was 0.6. The competent cells were packed in 50 μL per tube， and frozen in ethanol at -80℃. Then， 10 pg pUC 19 plasmid DNA was added， and the cells were transformed by electric shock under the conditions of 20 kv·cm-1 electric field intensity， 25 μF capacitance and 200 Ω resistance. After the transformation， the cells were cultured for 60 min. The transformation efficiency was above 1010 cfu·μg-1 DNA， which could meet the needs of genomic library construction and antibody library screening.

Key words： Escherichia coli； DH5a strain； Highefficiency； Electroporation transformation

自1972年Cohen等[1]首次報(bào)道將質(zhì)粒DNA成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli，E.coli后，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化已發(fā)展為一項(xiàng)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的常規(guī)技術(shù)，主要應(yīng)用于DNA片段克隆以及基因文庫構(gòu)建等方面，但不同試驗(yàn)場景對轉(zhuǎn)化效率要求存在較大差異，DNA片段克隆只需轉(zhuǎn)化效率在106 cfu·μg-1 DNA左右就可以滿足試驗(yàn)要求，而基因文庫構(gòu)建、抗體庫篩選等研究則需要1010 cfu·μg-1 DNA以上的轉(zhuǎn)化效率。目前大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法可分為物理法和化學(xué)法，化學(xué)法主要包括氯化鈣法[1]、Hanahan法[2]以及Inoue法[3]，其中氯化鈣法轉(zhuǎn)化效率在

106～108 cfu·μg-1 DNA，Hanahan法和Inoue法轉(zhuǎn)化效率在108 cfu·μg-1 DNA左右，偶能達(dá)到109 cfu·μg-1 DNA的水平，均不能滿足基因文庫構(gòu)建、抗體庫篩選等試驗(yàn)要求[4-5]。電擊轉(zhuǎn)化法作為一種物理方法，雖可將轉(zhuǎn)化效率提高至1010 cfu·μg-1 DNA以上水平，但需要提前對大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化方能達(dá)成。

大腸桿菌電擊轉(zhuǎn)化主要包括感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化兩個(gè)步驟[5-7]，目前在電擊轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化研究方面存在許多不足之處，主要表現(xiàn)在很多研究將電擊轉(zhuǎn)化的兩個(gè)步驟割裂開，一部分研究僅針對感受態(tài)細(xì)胞制備條件如菌體培養(yǎng)基、溫度、菌體生長狀態(tài)等條件進(jìn)行優(yōu)化，忽略了轉(zhuǎn)化條件對轉(zhuǎn)化效率的影響[8-9]，而另一部分研究則只針對轉(zhuǎn)化條件如轉(zhuǎn)化電場強(qiáng)度、恢復(fù)培養(yǎng)基成分和轉(zhuǎn)化后復(fù)蘇時(shí)間等方面進(jìn)行優(yōu)化[4，10-11]，沒有考慮到菌體生長狀態(tài)等感受態(tài)細(xì)胞制備條件帶來的影響，最終導(dǎo)致電擊轉(zhuǎn)化試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果不穩(wěn)定、重現(xiàn)性差。本研究以大腸桿菌DH5a菌株為試驗(yàn)對象，同時(shí)對電擊轉(zhuǎn)化條件中感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化條件中關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，篩選出高效電擊轉(zhuǎn)化條件，為基因文庫構(gòu)建、抗體庫篩選等試驗(yàn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株 大腸桿菌DH5a菌株、pUC 19質(zhì)粒均為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 材料與試劑 胰蛋白胨、酵母粉（英國Oxoid公司）；葡萄糖、瓊脂粉、氨芐青霉素、質(zhì)粒DNA提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]；NaCl、KCl、MgCl2、NaOH、甘油（分析純，上海阿拉丁生化科技有限公司）。

1.1.3 儀器與設(shè)備 分光光度計(jì)（TU1901，北京普析通用）；電脈沖基因轉(zhuǎn)化儀（Gene Pulser II，美國Biorad公司）；臺(tái)式離心機(jī)（Sigma 114，德國希格瑪公司）；超凈工作臺(tái)（C2HJHC1112B，上海智城公司）；核酸蛋白定量儀（Qubit 2，美國Thermo Scientific公司）；恒溫培養(yǎng)箱（DHP9082型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；0.2 cm電擊杯（美國Biorad公司）。

1.1.4 培養(yǎng)基 SOB培養(yǎng)基：2%（W/V）胰蛋白胨、0.5%（W/V）酵母粉、0.05%（W/V）NaCl、2.5 mmol·L-1 KCl、10 mmol·L-1 MgCl2。SOC培養(yǎng)基：2%（W/V）胰蛋白胨、0.5%（W/V）酵母粉、0.05%（W/V）NaCl、2.5 mmol·L-1 KCl、10 mmol·L-1 MgCl2、20 mmol·L-1葡萄糖。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞制備 取出從-80℃保存的大腸桿菌DH5α菌株，在SOB固體培養(yǎng)基上劃線，置37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，挑取大腸桿菌DH5α單菌落至5 mL SOB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200 r·min-1過夜培養(yǎng)12～15 h；用移液槍吸取0.5 mL過夜培養(yǎng)物，在超凈工作臺(tái)中按1∶100比例接種于50 mL SOB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)至不同生長狀態(tài)，在超凈工作臺(tái)上轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，冰浴10 min后在4℃、5000 r·min-1離心10 min，棄上清，收集細(xì)胞；加入50 mL 0℃預(yù)冷的18.25 MΩ的去離子水，用移液槍吹懸細(xì)胞，4℃、5000 r·min-1離心10 min，棄上清，收集細(xì)胞，重復(fù)洗滌細(xì)胞1次；加入25 mL 0℃預(yù)冷的10%甘油緩沖液，用移液槍吹懸細(xì)胞，4℃、5000 r·min-1離心10 min，棄上清，收集細(xì)胞；加入0.5 mL 10%甘油緩沖液吹懸細(xì)胞，按每管40 μL體積分裝后，-80℃保存。

1.2.2 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞電擊轉(zhuǎn)化 取1 ng pUC 19質(zhì)粒DNA，加入到40 μL 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，手指輕彈使pUC 19質(zhì)粒DNA和感受態(tài)細(xì)胞充分混勻，冰浴30 min；轉(zhuǎn)移至0℃預(yù)冷的電擊杯（內(nèi)徑0.2 cm）中，用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電擊（電壓22 kv·cm-1，電容25 μF，電阻200 Ω，電擊1次）；立即向電擊杯中加入960 μL SOC恢復(fù)培養(yǎng)基，移液槍反復(fù)輕輕吹打混勻，全部吸至離心管中，37℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)1 h后，涂布于含有終濃度為100 μg·mL-1氨芐青霉素的SOB固體培養(yǎng)基平板上，37℃過夜培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量，并計(jì)算感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率（轉(zhuǎn)化效率為每單位重量質(zhì)粒DNA產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子數(shù)量）。

1.2.3 生長狀態(tài)對大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響 分別選取培養(yǎng)至OD600=0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1和1.2的大腸桿菌DH5α菌液（按1.2.1中所述方法制備感受態(tài)細(xì)胞），并按1.2.2中所述電擊轉(zhuǎn)化后，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量，計(jì)算感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

1.2.4 質(zhì)粒DNA加入量對大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響 按1.2.3確定的最佳OD600值制備感受態(tài)細(xì)胞，分別取1、10、1、10和100 ng pUC 19質(zhì)粒DNA，加入到5個(gè)40 μL 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。按1.2.2中所述電擊轉(zhuǎn)化后，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量，計(jì)算感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

1.2.5 感受態(tài)細(xì)胞體積對大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響 按1.2.4優(yōu)化的質(zhì)粒DNA加入量，分別加入到40 μL·管-1、50 μL·管-1、60 μL·管-1、70 μL·管-1、80 μL·管-1分裝的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，按1.2.2中所述電擊轉(zhuǎn)化后，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量，計(jì)算感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

1.2.6 電場強(qiáng)度對大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響 按1.2.5優(yōu)化的感受態(tài)細(xì)胞體積，分別按16、18、20、22和24 kv·cm-1設(shè)置不同電場強(qiáng)度，電容25 μF，電阻200 Ω，0.2 cm電擊杯進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化后按1.2.2中所述后續(xù)操作，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量，計(jì)算感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

1.2.7 低溫速凍對大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響 將新制備的50 μL 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置-80℃預(yù)冷的乙醇中速凍5 min后，按1.2.6優(yōu)化的電場強(qiáng)度進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化后按1.2.2中所述后續(xù)操作，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量，計(jì)算感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

1.2.8 恢復(fù)時(shí)間對大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響 將速凍后的50 μL 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，按20 kv·cm-1、電容25 μF，電阻200 Ω設(shè)置參數(shù)，在0.2 cm電擊杯進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，立即向電擊杯中加入950 μL SOC恢復(fù)培養(yǎng)基，移液槍反復(fù)輕輕吹打混勻；將電擊杯中的菌液全部吸出至離心管中，37℃、180 r·min-1分別振蕩培養(yǎng)30、60、90和120 min，涂布于含有終濃度為100 μg·mL-1氨芐青霉素的SOB固體培養(yǎng)基平板上，37℃過夜培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量，并計(jì)算感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞生長狀態(tài)對大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響

由圖1可知，不同細(xì)胞生長狀態(tài)下所制備的感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率存在差異，其中以大腸桿菌DH5α細(xì)胞生長狀態(tài)OD600值為0.6時(shí)效果最好，轉(zhuǎn)化效率為10.7×108 cfu·μg-1 DNA。

2.2 質(zhì)粒DNA加入量對大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響

由圖2可知，過低或過高的質(zhì)粒DNA加入量均會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率降低，但在10 pg和1 ng的質(zhì)粒DNA加入量時(shí)，兩者的轉(zhuǎn)化效率明顯高于其他質(zhì)粒DNA加入量，分別為12.3×108 cfu·μg-1 DNA和12.5×108 cfu·μg-1 DNA。

2.3 感受態(tài)細(xì)胞體積對大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響

由圖3可知，不同的感受態(tài)細(xì)胞體積會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率出現(xiàn)高低起伏，其中以50 μL體積的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率最高，其轉(zhuǎn)化效率為4.2×109 cfu·μg-1 DNA。

2.4 電場強(qiáng)度對大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響

由圖4可知，不同電場強(qiáng)度下感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率會(huì)出現(xiàn)高低變化，其中以電場強(qiáng)度為20 kv·cm-1時(shí)，感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)7.8×109 cfu·μg-1 DNA。

2.5 低溫速凍對大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響

由圖5可知，-80℃乙醇速凍后，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率得到進(jìn)一步提升，已超過1010 cfu·μg-1 DNA，達(dá)到1.11×1010 cfu·μg-1 DNA水平。

2.6 恢復(fù)時(shí)間對大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的影響

由圖6可知，恢復(fù)時(shí)間為60 min時(shí)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率為1.12×1010 cfu·μg-1 DNA，恢復(fù)時(shí)間延長至90 min時(shí)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率進(jìn)一步提升至1.28×1010 cfu·μg-1 DNA，而再繼續(xù)延長恢復(fù)時(shí)間至120 min時(shí)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率為1.27×1010 cfu·μg-1 DNA，與90 min相比感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率提升不大，故恢復(fù)時(shí)間在60～90 min時(shí)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率可在1010 cfu·μg-1 DNA以上。

3 討論與結(jié)論

電擊轉(zhuǎn)化是目前已知的轉(zhuǎn)化方法中轉(zhuǎn)化效率最高的，其基本原理是利用作用于細(xì)胞膜兩側(cè)的高壓瞬時(shí)電場產(chǎn)生的電位差，使細(xì)胞膜極化形成可逆孔洞，這些孔洞可以使DNA一類的大分子進(jìn)入細(xì)胞[5，12]。有研究表明影響電轉(zhuǎn)化效率的最主要的因素是電池強(qiáng)度和細(xì)胞生長狀態(tài)，其中電場強(qiáng)度的增強(qiáng)會(huì)增加DNA的導(dǎo)入量，但也會(huì)造成細(xì)胞的大量死亡，只有當(dāng)電場強(qiáng)度和脈沖時(shí)長以一定方式組合而導(dǎo)致50%～70%的細(xì)胞死亡時(shí)轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高[9， 13-14]。因此，在進(jìn)行電轉(zhuǎn)化時(shí)，必須篩選合適的電場強(qiáng)度才可能達(dá)到最高的轉(zhuǎn)化效率。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在電場強(qiáng)度為20 kv·cm-1時(shí)，感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率最高，到7.8×109 cfu·μg-1 DNA。細(xì)菌的生長狀態(tài)也直接影響轉(zhuǎn)化效率。研究表明，在細(xì)菌生長需經(jīng)歷4個(gè)不同時(shí)期，其中以對數(shù)生長期早中期時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，而隨著細(xì)菌的老化其轉(zhuǎn)化效率也將大大降低。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同細(xì)胞生長狀態(tài)下感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率存在差異，其中以在OD600值為0.6時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高。

電擊轉(zhuǎn)化中質(zhì)粒DNA加入量、感受態(tài)細(xì)胞體積、速凍和恢復(fù)時(shí)間等因素也會(huì)對轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生影響，通過對上述條件優(yōu)化，最終最優(yōu)電擊轉(zhuǎn)化條件為：在細(xì)胞生長狀態(tài)OD600值為0.6制備感受態(tài)細(xì)胞，并按每管50 μL體積分裝-80℃乙醇速凍后，加入10 pg pUC 19質(zhì)粒DNA，在20 kv·cm-1電場強(qiáng)度、電容25 μF、電阻200 Ω條件下電擊轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后恢復(fù)培養(yǎng)60 min，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1010 cfu·μg-1 DNA以上水平。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）