吳志明　李慧　周易芬　曹正柳　張鵬　萬欣　郭健

【摘 要】目的：探討淫羊藿苷（ICA）是否通過上調(diào)TRIB1表達抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞（RA-FLS）炎癥。方法：收集南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的活動期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）患者的滑膜組織，分離培養(yǎng)RA-FLS后，用腫瘤壞死因子-α（TNF-α，10 ng·mL^-1）處理RA-FLS建立炎癥細(xì)胞模型。首先，為明確ICA抑制RA-FLS增殖和炎癥，促進細(xì)胞凋亡，分為空白對照組、TNF-α組、TNF-α + ICA組；然后，為明確TRIB1過表達可抑制RA-FLS的增殖和炎癥，促進細(xì)胞凋亡，空白vector或oe-TRIB1轉(zhuǎn)染TNF-α處理的RA-FLS，分為空白對照組、TNF-α組、TNF-α + vector組、TNF-α + TRIB1組；接著，為明確ICA以依賴于TRIB1的方式抑制NF-κB，siTRIB1轉(zhuǎn)染TNF-α處理的RA-FLS細(xì)胞，分為空白對照組、TNF-α組、TNF-α + ICA組、TNF-α + ICA + siTRIB1組。分別采用qRT-PCR、Western blot檢測基因和蛋白水平；ELISA檢測炎性細(xì)胞因子；CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖和凋亡。結(jié)果：ICA處理和TRIB1過表達均抑制TNF-α誘導(dǎo)的RA-FLS的增殖和炎癥反應(yīng)，且促進其凋亡。TNF-α處理后RA-FLS中p-p65和p-IκB水平顯著上調(diào)，但ICA顯著降低p-p65和p-IκB水平；且與siTRIB1聯(lián)合治療時，ICA的抑制作用消失。結(jié)論：ICA通過上調(diào)TRIB1抑制NF-κB緩解RA，提示ICA可能是一種有前景的治療RA藥物。

【關(guān)鍵詞】 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；淫羊藿苷；TRIB1；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；成纖維樣滑膜細(xì)胞

Icariin Alleviating Fibroblastic Synovial Cell Inflammation in Rheumatoid Arthritis by Upregulating TRIB1 to Inhibit NF-κB

WU Zhi-ming，LI Hui，ZHOU Yi-fen，CAO Zheng-liu，ZHANG Peng，WAN Xin，GUO Jian

【ABSTRACT】Objective：To investigate whether icariin（ICA）relieves inflammation of rheumatoid arthritis fibroblastic synovial（RA-FLS）cells by upregulating TRIB1 to inhibit nuclear transcription factors-κB（NF-κB）.Methods：The synovial tissue of patients with RA who underwent knee Joint replacement surgery in the First Affiliated Hospital of Nanchang University was collected，and RA-FLS cells were isolated and cultured.TNF-α（10 ng·mL^-1）was used to deal with RA-FLS cells to establish inflammatory cell models.Firstly，to clarify that ICA inhibits the proliferation and inflammation of RA-FLS cells and promote cell apoptosis，the blank control group，the TNF-α processing group，and the TNF-α + ICA group were established.Then，to clarify that overexpression of TRIB1 can inhibit the proliferation and inflammation of RA-FLS，and promote cell apoptosis，and blank vector or oe-TRIB1 was transfected into TNF-α processed RA-FLS cells，the Control group，the TNF-α processing group，the TNF-α + Vector group，TNF-α + TRIB1 group were established.Next，to clarify that ICA inhibits NF-κB dependent on TRIB1，and siTRIB1 transfecting TNF-α processed RA-FLS cells，the blank control group the TNF-α processing group，the TNF-α + ICA group，the TNF-α + ICA + siTRIB1 group were established.Gene and protein levels were detected using qRT-PCR?and Western blot，respectively;ELISA was used to detect inflammatory cytokines;and CCK-8 and flow cytometry were used to detect cell proliferation and apoptosis.Results：Both ICA treatment and TRIB1 overexpression inhibited TNF-α induced proliferation and inflammatory response of RA-FLS cells，and promoted their apoptosis.The levels of p-p65 and p-IκB in the TNF-α processed RA-FLS cells significantly upregulated，but ICA significantly reduced the levels of p-p65 and p-IκB.When combined with sitRIB1 in the treatment，the inhibitory effect of ICA disappears.Conclusion：ICA inhibits NF by upregulating TRIB1-κB to alleviate RA，suggesting that ICA may be a promising therapeutic drug for RA.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;icariin;TRIB1;nuclear transcription factor-κB;fibroblastic synovial cells

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種免疫性疾病，表現(xiàn)為對稱性關(guān)節(jié)炎，常伴有軟骨破壞、骨侵蝕［1］，是患者殘疾和生活質(zhì)量下降的常見原因［2-3］。RA發(fā)病涉及各類免疫細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）功能異常［4］。目前，免疫抑制劑（如甲氨蝶呤、來氟米特）和生物制劑等治療有一定的療效［5-6］，但患者面臨著巨大的經(jīng)濟和身體負(fù)擔(dān)。

淫羊藿苷（ICA）是中草藥淫羊藿的重要單體，具有骨愈合及骨保護作用［7］。PU等［8］發(fā)現(xiàn)，ICA通過抑制FLS增殖保護骨損害緩解RA；WEI等［9］發(fā)現(xiàn)，ICA可抑制RA小鼠的骨降解。說明ICA可用于治療RA，但機制不明。

哺乳動物TRIB家族蛋白主要包括TRIB1、TRIB2和TRIB3，在多種生物學(xué)和病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如糖尿病和關(guān)節(jié)炎［10］。TRIB1作為天然免疫的重要媒介，被證實在調(diào)控RA中發(fā)揮關(guān)鍵作用。OKUMA等［11］發(fā)現(xiàn)，TRIB1沉默導(dǎo)致腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和CCAAT/增強結(jié)合蛋白（C/EBP）β表達增加，促進軟骨降解。DUGAST等［12］發(fā)現(xiàn)，TRIB1過表達可提高FoxP3的表達控制RA。由此可見，TRIB1對RA具有巨大的調(diào)控作用，但TRIB1是否參與ICA對RA的調(diào)控尚不清楚。

研究證實，核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）通路可作為ICA的下游功能通路［13］，表明ICA、TRIB1和NF-κB之間可能存在聯(lián)系。本研究采用TNF-α誘導(dǎo)的RA-FLS探討ICA是否通過上調(diào)TRIB1抑制NF-κB改善RA。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑 ICA單體藥材（南京金斯瑞生物與科技公司，批號20190801）；抗TRIB1抗體、抗p-p65抗體、抗p65抗體、抗p-IκB抗體、抗IκB抗體、抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體、抗IL-6抗體、抗IL-8抗體、抗IL-1β抗體、抗β-actin抗體、抗Histone 3抗體（英國Abcam公司，1∶1000，批號分別為ab137717，ab76302，ab32536，ab133462，ab32518，ab32503，ab32124，ab214429，ab235584，ab216995，ab8227，ab267372）；二抗（英國Abcam公司，1∶10 000，批號ab7090）；人IL-1β、IL-6和IL-8 ELISA試劑（Sigma-Aldrich，批號分別為RAB0273，RAB0306，RAB0319）；oe-TRIB1過表達質(zhì)粒及其陰性對照載體（中國上海GenePharma公司）；Lipofectamine?3000（美國Invitrogen公司，批號L3000008）；CCK-8試劑［生工生物工程（上海）股份有限公司，批號E606335］；Annexin V-FITC和PI染色試劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C1062L）；TRIzol （Thermo Fisher Scientific公司，批號15596018）；逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（日本東京Toyobo公司，批號FSQ-101）；Ultra SYBR混合試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司，批號1176202K）。

1.2 臨床標(biāo)本 滑膜組織取自接受膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)的活動期RA患者，符合美國風(fēng)濕病學(xué)會（ACR）修定的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)［14］。本研究通過南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查，所有參與者均簽署知情同意書，倫理編號（2021）醫(yī)研倫審第（9-006）號。

1.3 主要儀器 微孔板分光光度計（型號NanoDrop 2000c，美國Thermo Fisher Scientific公司）；倒置顯微鏡（型號IX73，日本奧林巴斯公司）；凝膠成像系統(tǒng)（型號Gel Doc EZ，美國Bio-Rad）；轉(zhuǎn)膜儀（型號170-3940，英國 Biorad 公司）。

2 方 法

2.1 RA-FLS分離、培養(yǎng)及處理 將收集的RA滑膜組織切成小塊，與膠原酶Ⅰ在37 ℃下孵育3 h，分離RA-FLS。細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)為1%的青霉素/鏈霉素溶液DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為體積分?jǐn)?shù)為5%的CO₂、37 ℃。培養(yǎng)結(jié)束后用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，直到融合度達到95%，收集細(xì)胞，重新懸浮，種植增殖。選取第3～6代RA-FLS進行后續(xù)實驗。建立炎癥細(xì)胞模型，用TNF-α（10 ng·mL^-1）預(yù)處理RA-FLS 24 h，然后用不同摩爾濃度（10，20，40，80 μmmol·L^-1）的ICA再處理炎癥細(xì)胞24 h。

2.2 ICA單體藥液的配制 參照ICA配制說明書調(diào)配母液即儲存液。按說明書中ICA單體/DMSO溶劑：10 mg/14.778 5 mL比例進行調(diào)配。首先，取50 mL離心管，在管內(nèi)放入稱取的10 mg ICA單體粉末，然后加入14.778 5 mL的DMSO溶劑，充分溶解混勻，即配成10 mmol·L^-1的母液，常溫保存。使用時根據(jù)所需濃度按照一定比例進行稀釋，即得到所需濃度的藥液。

2.3 實驗分組 首先，為明確ICA抑制RA-FLS細(xì)胞增殖和炎癥，促進細(xì)胞凋亡，分為空白對照組、TNF-α組、TNF-α + ICA組；然后，為明確TRIB1過表達可抑制RA-FLS的增殖和炎癥，促進細(xì)胞凋亡，空白vector或oe-TRIB1轉(zhuǎn)染TNF-α處理的RA-FLS細(xì)胞，分為空白對照組、TNF-α組、TNF-α + vector組、TNF-α + TRIB1組；接著，為明確ICA以依賴于TRIB1的方式抑制NF-κB，siTRIB1轉(zhuǎn)染TNF-α處理的RA-FLS細(xì)胞，分為空白對照組、TNF-α組、TNF-α + ICA組、TNF-α + ICA + siTRIB1組。

2.4 實驗檢測指標(biāo)及方法

2.4.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 siTRIB1、oe-TRIB1以及它們的陰性對照（空白vector）從GenePharma獲得。體外轉(zhuǎn)染時，使用Lipofectamine? 3000將載體和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。驗證TRIB1過表達可抑制RA-FLS的增殖和炎癥時，TNF-α + vector組中TNF-α處理的RA-FLS用空白vector進行轉(zhuǎn)染；TNF-α +?TRIB1組中TNF-α處理的RA-FLS用oe-TRIB1進行轉(zhuǎn)染。驗證ICA以依賴于TRIB1的方式抑制NF-κB通路激活時，TNF-α + ICA + siTRIB1組中TNF-α + ICA處理的RA-FLS用siTRIB1轉(zhuǎn)染。

2.4.2 CCK8檢測細(xì)胞活性實驗 將不同處理的細(xì)胞（2×10⁴）接種于96孔板中培養(yǎng)。然后，細(xì)胞與10 μL的CCK-8溶液孵育2 h。使用微孔板分光光度計在450 nm處檢測吸光度。

2.4.3 細(xì)胞凋亡實驗 處理后，收集細(xì)胞，PBS洗滌，用500 μL 1X Annexin-binding buffer重懸。然后用Annexin V-FITC和PI染色孵育細(xì)胞10 min。

立即用流式細(xì)胞儀分析樣品。

2.4.4 免疫印跡實驗（Western blot） 用RIPA分離蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后膜與TRIB1、p-p65、p65、p-IκB、Bax、Bcl-2、IL-6、IL-8、IL-1β、β-actin抗體和組蛋白3孵育過夜。PBS-T洗滌后，膜與相應(yīng)的二抗孵育60 min。用GEL成像系統(tǒng)對膜進行可視化和成像。蛋白定量用Image J軟件進行分析。

2.4.5 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA） 采用人IL-1β、IL-6和IL-8 ELISA試劑盒，按照相應(yīng)的說明程序檢測IL-1β、IL-6和IL-8水平。最后的數(shù)據(jù)在microboard reader中測量。

2.4.6 qRT-PCR實驗 使用TRIzol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成cDNA。然后，使用Ultra SYBR mix試劑盒對cDNA進行qRT-PCR檢測。mRNA的相對表達量用GAPDH歸一化，2?ΔΔCT法計算。引物序列見表1。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示；方差分析前采用Shapiro-Wilk檢驗對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性評估，方差齊性分析采用Bartlett檢驗；兩兩比較采用Student's t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 RA-FLS的培養(yǎng)鑒定及活性檢測 采用膠原酶消化培養(yǎng)法分離人RA-FLS，6 h左右貼壁細(xì)胞比率達60%，20 d左右細(xì)胞融合度可達70%，約４周融合度達95%，細(xì)胞形態(tài)見RA-FLS貼壁聚集生長，呈長梭形或紡錘形，類神經(jīng)元細(xì)胞，胞核位于細(xì)胞中央，見圖1。Vimentin是在RA-FLS中特異表達的微絲蛋白［15］，采用細(xì)胞免疫熒光實驗顯示細(xì)胞表達綠色Vimentin微絲蛋白，證明本研究分離培養(yǎng)的細(xì)胞為RA-FLS，且Vimentin細(xì)胞陽性率 > 95%，獲得均一性良好的RA-FLS，見圖1（2）。

3.2 ICA對RA-FLS增殖和炎癥作用及對細(xì)胞凋亡的促進作用 TNF-α能顯著促進RA-FLS增殖，ICA預(yù)處理能顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的RA-FLS增殖，且呈濃度依賴性，見表2。凋亡檢測表明，TNF-α刺激后RA-FLS凋亡顯著減少，而ICA處理后細(xì)胞凋亡明顯增加。ELISA表明，TNF-α處理導(dǎo)致RA-FLS中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8顯著增加，但ICA處理顯著降低上述炎性細(xì)胞因子，見表3。ICA治療后，TNF-α處理引起的Bcl-2、IL-1β、IL-6和IL-8蛋白水平升高受到抑制，Bax蛋白水平反而升高，見表4。

3.3 TRIB1過表達對RA-FLS細(xì)胞增殖和炎癥的抑制作用及對RA-FLS凋亡的誘導(dǎo)作用 TRIB1對RA的疾病活動及進展具有較大的調(diào)控作用。為了進一步明確TRIB1在RA中的作用，將空白vector或oe-TRIB1轉(zhuǎn)染到RA-FLS中。在oe-TRIB1轉(zhuǎn)染的TNF-α處理的RA-FLS中TRIB1水平顯著升高，p-p65和p-IκB水平顯著抑制，見表5；過表達的TRIB1顯著抑制RA-FLS細(xì)胞增殖和促炎細(xì)胞因子的釋放，并且促進其凋亡，見表6。此外，TRIB1過表達后，TNF-α對Bcl-2、IL-1β、IL-6、IL-8蛋白水平的促進作用以及對Bax水平的抑制作用幾乎受到抑制，見表7。

3.4 ICA以依賴于TRIB1的方式對NF-κB通路激活的抑制作用 TRIB1是炎癥信號通路的關(guān)鍵上游調(diào)節(jié)因子。首先，Western blot和qRT-PCR檢測顯示，TNF-α處理使TRIB1表達受到抑制，ICA治療后表達增加，轉(zhuǎn)染siTRIB1逆轉(zhuǎn)了ICA對TNF-α處理的RA-FLS中TRIB1表達的促進作用，見表8、表9。同時發(fā)現(xiàn)，TNF-α處理后RA-FLS中p-p65和p-IκB蛋白水平顯著上調(diào)，ICA顯著降低p-p65和p-IκB蛋白水平，但與siTRIB1聯(lián)合治療時，ICA的抑制作用消失，見表8。

4 討 論

RA是一種以滑膜炎為特征的慢性炎癥性疾病，滑膜炎會導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞［16］。正常情況下，F(xiàn)LS是滑膜組織的核心組成，維持膝關(guān)節(jié)的動態(tài)穩(wěn)定及結(jié)構(gòu)完整性［17］。然而在RA中，免疫微環(huán)境改變導(dǎo)致FLS具有過度增殖和惡性侵襲等生物學(xué)特征，表達參與軟骨和非骨支持結(jié)構(gòu)破壞相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶，促進破骨分化和抑制骨修復(fù)引起骨侵蝕［18-19］。因此，靶向RA-FLS是一種很有前途的RA治療策略。

淫羊藿辛、甘、溫，具有祛風(fēng)濕、補腎陽、強筋骨功效，深得扶陽派醫(yī)者喜愛。認(rèn)為淫羊藿能夠引陽入陰，且在溫補陽氣的同時又能使陰平陽秘［20］。對于痹證日久累及肝腎等臟腑者，常與附子、威靈仙、杜仲等配伍使用［21］。ICA為從淫羊藿中提取出來的活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、延緩衰老、抗骨質(zhì)疏松、改善心肌缺血缺氧、平衡免疫功能、增強生殖內(nèi)分泌性能等多種藥理功效［22］。

前期研究發(fā)現(xiàn)，ICA可通過作用于miR-223-3p緩解RA［23］。最近有學(xué)者研究也表明，ICA抑制FLS的增殖、遷移和細(xì)胞因子分泌［24］，但其機制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，ICA抑制RA-FLS增殖，且促進其凋亡。IL-1β、IL-6和IL-8作為一種重要的細(xì)胞因子被證實對RA的發(fā)展至關(guān)重要［25］。本研究結(jié)果顯示，在RA-FLS中，抗凋亡蛋白Bcl-2及炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和IL-8被ICA抑制，促凋亡蛋白Bax升高，表明ICA可能通過作用于RA-FLS緩解RA。

TRIB蛋白在癌癥和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。TRIB1是先天免疫的重要中介，是TRIB家族的重要成員。在RA中，TRIB1也通過調(diào)控基因表達和信號通路發(fā)揮抗炎作用［10］，但TRIB1如何參與ICA對RA的調(diào)控尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，在TNF-α處理的RA-FLS中TRIB1表達顯著降低，而ICA處理后顯著上調(diào)。過表達TRIB1時，RA-FLS凋亡增加，增殖減少，炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和IL-8分泌及蛋白表達減少，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少，促凋亡蛋白Bax表達增加。此外，敲除TIRB1可以逆轉(zhuǎn)ICA對TNF-α處理的RA-FLS細(xì)胞的抑制作用，表明TRIB1過表達在TNF-α處理的RA-FLS中發(fā)揮保護作用，提示TRIB1可能是ICA在TNF-α介導(dǎo)的RA-FLS中的功能靶點。

在RA中，NF-κB激酶抑制劑磷酸化促進IκBα的降解，并導(dǎo)致NF-κB的釋放，釋放的NF-κB促進下游靶點的轉(zhuǎn)錄，包括IL-1β、IL-6和IL-8，導(dǎo)致RA進展［26］。本研究結(jié)果顯示，TNF-α處理使TRIB1表達受到抑制，ICA處理后表達增加，敲降TRIB1逆轉(zhuǎn)了ICA對TRIB1表達的促進作用。TNF-α處理后，RA-FLS中p-p65和p-IκB蛋白水平顯著上調(diào)，但ICA顯著降低p-p65和p-IκB蛋白水平。在TRIB1基因敲除后，ICA對RA-FLS中p-p65和p-IκB蛋白水平的抑制作用顯著降低。因此，ICA通過上調(diào)TRIB1表達抑制NF-κB。

綜上所述，本研究從細(xì)胞水平首次證實ICA通過上調(diào)TRIB1抑制NF-κB信號促下游炎性細(xì)胞因子的釋放，從而抑制RA-FLS炎癥，具有重要臨床意義。然而，目前國內(nèi)外對于ICA抵抗RA的研究尚不足，以單靶點、單一信號通路為主。如雷杰等［27］通過NLRP3炎性小體信號通路研究ICA對RA小鼠的干預(yù)作用。針對多信號通路等研究尚缺乏。因此，需進一步從細(xì)胞水平、動物水平、臨床水平開展代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等多層次、多靶點、多通路的全方位研究，全面闡明ICA抗RA的效應(yīng)機制，為開發(fā)用于抗RA提供有力的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，促進我國中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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收稿日期：2023-02-01；修回日期：2023-03-19