元寶華 李興勇 方鵬飛 藺海生 劉曉婷

摘要：目的 觀察杜仲腰痛丸對(duì)大鼠脊髓損傷后NLRP3炎癥小體表達(dá)的影響，探討該藥對(duì)脊髓損傷后炎癥反應(yīng)的作用和其作用原理

方法 將50只SD大鼠隨機(jī)分成5組，每組10只。分別是A組（低劑量組）、B組（中劑量組）、C組（高劑量組）、D組（模型組）、E組（假手術(shù)組）。A組、B組、C組與D組進(jìn)行脊髓損傷造模，E組行椎板切除術(shù)。A組、B組、C組分別按照濃度梯度給予杜仲腰痛丸干預(yù)，D組和E組則給予同等量的生理鹽水干預(yù)，實(shí)驗(yàn)的前后每組分別采用 Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）運(yùn)動(dòng)能力評(píng)定量表評(píng)估大鼠后肢的聯(lián)合運(yùn)動(dòng)功能，實(shí)驗(yàn)第7天取材檢測(cè)NLRP3蛋白的相對(duì)表達(dá)，并分析其結(jié)果。

結(jié)果 術(shù)后A組、B組、C組的BBB評(píng)分均優(yōu)于D組（P<0.05），治療效果有時(shí)間依賴性；免疫組化法D組同E組相比較，D組NLRP3炎癥體表達(dá)相對(duì)比較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；A組、B組、C組與D組相比較，A組、B組、C組NLRP3表達(dá)相對(duì)減少，C組的表達(dá)相對(duì)最少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

結(jié)論 證實(shí)杜仲腰痛丸可以抑制脊髓損傷部位NLRP3的表達(dá)，減緩炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：杜仲腰痛丸；脊髓損傷；NLRP3；炎癥反應(yīng)

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1007-2349（2023）07-0001-03

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是脊柱節(jié)段控制系統(tǒng)和自主神經(jīng)系統(tǒng)被破壞，導(dǎo)致痙攣性麻痹、疼痛感覺遲鈍、交感神經(jīng)遲鈍和副交感神經(jīng)興奮，產(chǎn)生心律失常、全身性低血壓、支氣管收縮、呼吸道產(chǎn)生大量分泌物、腸道、膀胱和性功能障礙等癥狀，具有比較高的發(fā)病率以及致殘率［1-4］。由于血脊髓屏障的破壞，損傷部位組織缺血，循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)炎癥細(xì)胞趨化因子誘導(dǎo)損傷組織周圍發(fā)生炎癥反應(yīng)，致使炎癥反應(yīng)介導(dǎo)周圍組織壞死和凋亡。而在SCI后眾多病理反應(yīng)中，炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生影響最大。杜仲腰痛丸（由杜仲、川芎、赤芍、川牛膝、土鱉蟲等組成）常用于治療脊柱源性疾病，研究證實(shí)杜仲腰痛丸可以抑制炎癥反應(yīng)，起到緩解疼痛的作用［5-6］。但杜仲腰痛丸能否抑制SCI后NLRP3炎性小體介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，尚未有這方面的實(shí)驗(yàn)研究。本研究將杜仲腰痛丸應(yīng)用于脊髓損傷動(dòng)物模型，觀察其對(duì)SCI后NLRP3炎癥體表達(dá)的影響，并探討其中機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雌性大鼠50只，6-8周齡，體重（210±9.70）g，于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購得，許可證號(hào)碼：SCXK（甘）2020-0002，所有大鼠按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理與操作實(shí)用指南進(jìn)行照料和處理，每籠5只，在相同條件下飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)為期1周，若此期間實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沒有出現(xiàn)不良反應(yīng)，繼而開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 杜仲腰痛丸，組成包括杜仲、川芎、赤芍、川牛膝、土鱉蟲等十七味中藥，每瓶220丸，每粒含生藥0.18 g，由甘肅省中醫(yī)院制劑中心生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)：210653。配制成每毫升含生藥0.05 g的藥液，無菌條件下裝入試劑瓶冰箱低溫冷藏保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)中用到的試劑：兔抗鼠NLRP3抗體（Proteintech）；免疫組化試劑盒（博士德）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 50只SD大鼠被隨機(jī)分成5組，每組10只。分別是A組（低劑量組）、B組（中劑量組）、C組（高劑量組）、D組（模型組）、E組（假手術(shù)組）。所有大鼠均用1％戊巴比妥鈉（60 mg/Kg）腹腔注射麻醉。8％Na2S背部脫毛，常規(guī)消毒后鋪無菌洞巾，定位棘突后以T10棘突為中心，用手術(shù)刀切開皮膚形成一道長約3cm的切口，鈍性剝離周圍軟組織后顯露T10、T9、T11的棘突，并用蚊式咬骨鉗咬除T10及部分T9、T11棘突和椎板，形成大小約4×8 mm的骨窗，暴露脊髓背側(cè)硬膜，用止血鉗輕夾脊髓，出現(xiàn)后肢伸展和甩尾反射則標(biāo)志著建模成功，形成中度及重度脊髓損傷模型。E組（假手術(shù)組）只進(jìn)行椎板切除，脊髓沒有受到壓迫。局部使用適量青霉素，預(yù)防施術(shù)部位發(fā)生感染，逐層縫合關(guān)閉切口，術(shù)中所有操作必須在無菌條件下進(jìn)行。為防止術(shù)后感染，給予青霉素腹腔注射3 d，4萬單位／N／只。觀察大鼠皮膚有無損傷或感染，必要時(shí)繼續(xù)注射青霉素。保持室溫20～25℃，相對(duì)濕度在50%～65%，提供（12 h光照/12 h黑暗）穩(wěn)定的晝夜光照變化，保持24 h通風(fēng)換氣，大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間可自由獲取食物和水。為防止大鼠聚集舔舐背部傷口，所有大鼠均在清潔環(huán)境下單籠飼養(yǎng)。食物為商用大鼠顆粒飼料，飲水瓶為無毒耐高壓塑料材料制成，飲水和飲水瓶經(jīng)過高溫滅菌消毒后使用，每日定時(shí)投食更換飲水，確保大鼠有充足的營養(yǎng)供給。每天進(jìn)行兩次人工排尿，并清除大鼠尿道附近污漬并消毒，以防止尿路感染，一直持續(xù)到大鼠恢復(fù)自主排尿功能。造模成功之后，A組給予杜仲腰痛丸湯劑灌胃，給藥劑量為0.42 g/（kg·ｄ），每日2次；B組給予杜仲腰痛丸湯劑灌胃，給藥劑量為0.84 g/（kg·ｄ），每日2次；C組給予杜仲腰痛丸湯劑灌胃，給藥劑量為1.68 g/（kg·ｄ），每日2次；D組和E組分別給予等量的生理鹽水，每日2次。連續(xù)干預(yù)7 d。所有動(dòng)物均在實(shí)驗(yàn)期間存活，無不良反應(yīng)，并納入數(shù)據(jù)分析。

1.3 觀察指標(biāo) 每組大鼠分別在術(shù)前及術(shù)后第1 d、第3 d、第5 d、第7 d用 BBB肢體運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分（范圍為0～21分）；術(shù)后第7 d取材，運(yùn)用免疫組化法檢測(cè)NLRP3炎癥體表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集用（x±s）表示，符合正態(tài)分布用ｔ檢驗(yàn)或單因素方差分析，非正態(tài)分布資料用秩和檢驗(yàn)，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

我們發(fā)現(xiàn)A組、B組、C組和D組的大鼠在SCI后立即失去后肢活動(dòng)功能，治療結(jié)果顯示杜仲腰痛丸能促進(jìn)神經(jīng)元功能恢復(fù)，并且有時(shí)間依賴性。我們的BBB評(píng)分（表1）顯示，A組的功能恢復(fù)明顯高于D組，表明杜仲腰痛丸可以改善SCI后的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。我們使用免疫組化技術(shù)評(píng)估了每組NLRP3炎癥體的表達(dá)變化。

2.1 BBB評(píng)分 用BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)定量表評(píng)定大鼠后肢的運(yùn)動(dòng)功能。于術(shù)前及術(shù)后第1 d、第3 d、第5 d、第7 d，將各組大鼠置于開闊場(chǎng)地內(nèi)自由活動(dòng)，記錄員（雙人、雙盲）負(fù)責(zé)對(duì)每只大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)能力評(píng)分。每只大鼠的運(yùn)動(dòng)評(píng)分最終結(jié)果取平均值，得出結(jié)果值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（表1）。

與E組相比較，A組、B組、C組和D組的BBB肢體運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分顯著下降，但是隨著治療時(shí)間的延長，A組、B組、C組和D組的BBB肢體運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分逐漸升高，到手術(shù)后第3天開始，A組、B組、C組BBB肢體運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分優(yōu)于D組同時(shí)期的結(jié)果（P<0.01）（見圖1）。這表明杜仲腰痛丸可以改善SCI后的運(yùn)動(dòng)功能，促進(jìn)神經(jīng)元的恢復(fù)。

2.2 免疫組化學(xué)法檢測(cè)NLRP3炎癥體的變化 運(yùn)用免疫組化學(xué)法檢測(cè)，NLRP3炎癥小體陽性表達(dá)呈深灰褐色，表達(dá)的位置主要在細(xì)胞漿之中（見圖2）。E組只能觀察到少量的NLRP3炎癥小體表達(dá)，D組中NLRP3炎癥小體在細(xì)胞漿中大量表達(dá)（見表2），A組的NLRP3炎癥體表達(dá)量明顯少于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（見圖3）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究顯示，運(yùn)用免疫組化學(xué)法檢測(cè)，NLRP3炎癥小體陽性表達(dá)呈深灰褐色，表達(dá)的位置主要在細(xì)胞漿之中。E組只能觀察到少量的NLRP3炎癥小體表達(dá)，D組中NLRP3炎癥小體在細(xì)胞漿中大量表達(dá)，A組、B組、C組的NLRP3炎癥體表達(dá)量明顯少于D組，說明杜仲腰痛丸可以抑制NLRP3的活化，減輕脊髓損傷后繼發(fā)的炎癥反應(yīng)，從而起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。

炎癥反應(yīng)是造成脊髓繼發(fā)性損傷的主要原因，脊髓損傷后使小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞被激活，這些細(xì)胞會(huì)分泌大量的炎性細(xì)胞因子和趨化因子，致使炎癥區(qū)域擴(kuò)大，形成纖維蛋白凝塊和膠質(zhì)瘢痕，并釋放大量抑制神經(jīng)和突觸修復(fù)的細(xì)胞因子（如 IL-1、TNF-α和 IL-6），炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重，從而讓中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生和修復(fù)變的更加艱難［7-9］。

NLRP3炎性小體是免疫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)免疫功能重要的一個(gè)組成部分，作為caspase-1的激活平臺(tái)，它可以控制細(xì)胞炎癥因子和細(xì)胞因子的處理和釋放［10-11］。NLRP3在特定的條件下被激活后，使caspase-1發(fā)生活化，活性的caspase-1則會(huì)促進(jìn)IL-1β和IL-18的活化［12-13］，IL-1β和IL-18都促進(jìn)活性氧（ROS）的積累，而ROS又充當(dāng)損傷相關(guān)的分子模式（DAMPs），使NLRP3炎性體被激活和caspase-1發(fā)生活化，進(jìn)一步產(chǎn)生IL-18和凋亡激活，從而引起反饋環(huán)，使炎癥反應(yīng)進(jìn)行性加重［10，14］。NLRP3激活的確切機(jī)制和它調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的機(jī)理，尚未研究透徹，但可能有多種調(diào)節(jié)機(jī)制和分子對(duì)NLRP3炎癥反應(yīng)起積極或消極的調(diào)節(jié)作用。SCI使NLRP3激活產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子會(huì)產(chǎn)生炎癥環(huán)境，從而加劇SCI的炎癥反應(yīng)，從而惡化疾病的預(yù)后。

大量研究表明，中醫(yī)藥在治療SCI上有其獨(dú)特的經(jīng)驗(yàn)和優(yōu)勢(shì)［15］。杜仲腰痛丸由杜仲、川芎、赤芍、川牛膝、土鱉蟲等組成，具有補(bǔ)益肝腎，通督脈、止痛消腫的功效。文獻(xiàn)研究表明服用杜仲腰痛丸后患者臨床癥狀明顯改善，血清IL-1、TNF-α的水平降低，IL-10水平升高，這表明杜仲腰痛丸有抗炎、緩解疼痛的作用［6］。

綜上所述，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果，說明杜仲腰痛丸可以抑制NLRP3的活化，從而減輕脊髓損傷后繼發(fā)的炎癥反應(yīng)，起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。但是具體的作用過程還未可知，是直接結(jié)合NLRP3炎性體從而抑制炎性反應(yīng)，或者是通過其他途徑來影響NLRP3炎性小體的激活，其中原理還需要在以后的實(shí)驗(yàn)研究中去探究證實(shí)。

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（收稿日期：2022-70-18）