羅曉麗，肖娟麗，王志安，劉圓，張安紅，吳家和

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所/ 棉花種質(zhì)資源利用與分子生物學(xué)設(shè)計育種山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 運(yùn)城 044000；2.中國科學(xué)院微生物研究所/ 植物基因組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101）

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，在經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有重要地位。因此利用生物技術(shù)改良棉花品種具有重要的意義。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對棉花進(jìn)行遺傳改良是一種高效的分子育種手段，轉(zhuǎn)基因不僅能夠拓寬可利用的基因資源，也為棉花功能基因的驗(yàn)證和應(yīng)用提供有效的技術(shù)支撐[1]。將調(diào)控農(nóng)藝性狀的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)化到棉花中，提高其產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性，將其它外源基因轉(zhuǎn)入到棉花中增加植株的抗蟲性、抗除草劑特性，可以在提高棉花生產(chǎn)效率的同時減輕環(huán)境污染[2]。例如，轉(zhuǎn)Bt抗蟲棉20 多年的廣泛種植，對棉花生產(chǎn)效率的提高作出了巨大貢獻(xiàn)，并且減少了殺蟲劑的使用，利于保護(hù)環(huán)境[3]。

目前棉花遺傳轉(zhuǎn)化最主要的方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，常規(guī)流程是用農(nóng)桿菌菌液浸染棉花下胚軸切段并共培養(yǎng)后，將轉(zhuǎn)化的下胚軸外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和篩選培養(yǎng)，再將誘導(dǎo)出的抗性愈傷組織進(jìn)行增殖培養(yǎng)和分化培養(yǎng)以獲得轉(zhuǎn)基因再生植株，隨后在溫室或網(wǎng)室嫁接再生植株，生長直至收獲種子。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花轉(zhuǎn)基因體系是以體細(xì)胞再生為基礎(chǔ)，需要進(jìn)行較長時間的組織培養(yǎng)。在棉花體細(xì)胞胚發(fā)生和植株再生過程中常伴隨著大量的畸形胚和苗，轉(zhuǎn)基因棉花材料具有不穩(wěn)定性，尤其是T0代轉(zhuǎn)化植株存在大量的不育株，有些占比高達(dá)80%以上[4-5]。張家明等[6]研究得出體細(xì)胞培養(yǎng)獲得的再生植株中存在較大變異，其中育性變異表現(xiàn)最突出。前人關(guān)于不育再生植株的細(xì)胞學(xué)分析及探究棉花體細(xì)胞組織培養(yǎng)對不育變異影響的研究較多，研究發(fā)現(xiàn)造成再生植株不育的主要原因是染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異[7-10]。陳志賢等[7]對棉花體細(xì)胞培養(yǎng)再生不育株的性狀及細(xì)胞學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，與再生可育株相比，不育植株的分枝、葉、花和植株等均較小，花柱、柱頭、花絲、花藥小且萎縮呈干癟狀，花藥不開裂；不育株花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂異常，普遍出現(xiàn)染色體丟失、配對異常、單價體和染色體橋，形成二分體、三分體或多分體；不育株雄配子體和雌配子體發(fā)育異常，胚囊結(jié)構(gòu)不完整，反足細(xì)胞解體延遲，造成不育。Bajaj 等[8]、郭香墨等[9]對陸地棉體細(xì)胞培養(yǎng)的染色體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)愈傷組織細(xì)胞的染色體數(shù)目變異較大。王坤波等[10]對轉(zhuǎn)基因棉花早代材料細(xì)胞學(xué)變異的研究揭示了染色體數(shù)目的減少、花粉母細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)變異是轉(zhuǎn)基因棉花高度敗育的直接原因。組織培養(yǎng)時間延長也會導(dǎo)致棉花體細(xì)胞的變異，Stelly等[11]、張寶紅等[12]在棉花組織培養(yǎng)中的表型變異研究證明，隨著培養(yǎng)時間的延長，染色體變異的頻率升高、畸形胚增多、變異的性狀和變異的范圍擴(kuò)大，表明培養(yǎng)時間是造成變異的重要原因之一。薛美鳳等[13]研究發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力雖然可保持較長時間，但隨著繼代時間的延長，再生能力逐漸下降，畸形胚發(fā)生率和再生植株不育率逐漸升高。在對不同品種棉花體細(xì)胞再生植株育性研究中,亓建飛等[5]發(fā)現(xiàn)不同品種的胚狀體均存在染色體變異，以染色體數(shù)目為27～52 條的非整倍變異最多，且不同品種的染色體變異率差別大，其中胚胎發(fā)生能力弱的品種的染色體變異率高。在棉花基因功能及轉(zhuǎn)基因新種質(zhì)創(chuàng)制的研究中，如何降低棉花遺傳轉(zhuǎn)化過程中的不育株率是亟待解決的問題之一。為探究不同轉(zhuǎn)化載體大小、目標(biāo)基因片段大小、出愈-分化的組織培養(yǎng)時間、分化- 再生植株（簡稱為分化- 再生）的組織培養(yǎng)時間對育性的影響，對6 個不同轉(zhuǎn)化載體和插入片段大小的轉(zhuǎn)基因再生植株育性進(jìn)行研究，分析造成轉(zhuǎn)基因T0植株不育的原因，為棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系改良提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1棉花材料。試驗(yàn)以體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力較強(qiáng)的棉花品種冀合713 為轉(zhuǎn)基因受體材料。

1.1.2各階段所需培養(yǎng)基。農(nóng)桿菌培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為通用的LB 培養(yǎng)基，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化過程及棉花組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基如表1 所示。

表1 棉花組織培養(yǎng)所用培養(yǎng)基Table 1 The medium for culture

1.1.3植物表達(dá)載體。本試驗(yàn)所用植物表達(dá)載體來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所鄭州科研中心劉傳亮課題組。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和酶切技術(shù)進(jìn)行目標(biāo)載體的構(gòu)建，農(nóng)桿菌菌株均為LBA4404，植物表達(dá)載體詳細(xì)信息見表2，載體構(gòu)建所用引物信息見表3。

表2 植物表達(dá)載體信息Table 2 Information of plant expression vectors

表3 轉(zhuǎn)基因植株鑒定所用的引物Table 3 Primers for detecting transgenic plants

1.1.4農(nóng)桿菌菌液的制備。分別挑取攜帶目的基因的農(nóng)桿菌菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)過夜至OD600值為0.3～0.7，將培養(yǎng)過夜的農(nóng)桿菌稀釋數(shù)百倍后在含有50 mg·L—1卡那霉素和25 mg·L—1利福平的LB 固體培養(yǎng)基上劃線，在28 ℃條件下培養(yǎng)24 h 后保存，每隔2個月繼代活化一次。轉(zhuǎn)化前挑取混合單菌落，接種到LB 液體培養(yǎng)基（含50 mg·L—1卡那霉素和25 mg·L—1利福平），26～28 ℃振蕩培養(yǎng) （180～200 r·min—1）過夜（約24 h）至對數(shù)生長期（OD600值為0.3～0.5 為宜，肉眼觀察利福平的紅色正好褪去）。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的農(nóng)桿菌菌液用液體LB 稀釋100 倍，加入50 mg·L—1乙酰丁香酮（acetosyringone,AS），26～28 ℃振蕩培養(yǎng)（180～200 r·min—1）0.5～1.0 h 備用。

1.2 試驗(yàn)方法

本研究參考已發(fā)表的轉(zhuǎn)化方法和棉花組織培養(yǎng)方法[14-16]，以下胚軸切段為外植體將表2 中6個轉(zhuǎn)化載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)過共培養(yǎng)、篩選、愈傷組織誘導(dǎo)、胚性愈傷組織分化、體細(xì)胞胚胎發(fā)生、植株再生、再生植株嫁接等過程，最終獲得轉(zhuǎn)基因植株。

1.2.1組織培養(yǎng)試驗(yàn)操作。于2018 年11 月13日、11 月27 日、12 月11 日分別對6 個載體進(jìn)行了3 次轉(zhuǎn)化（即3 次重復(fù)），每次重復(fù)每個載體轉(zhuǎn)化的外植體數(shù)為320（下胚軸切段數(shù)）。農(nóng)桿菌浸染后的下胚軸外植體在M2 培養(yǎng)基共培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基M3 中黑暗培養(yǎng)1 個月、光培養(yǎng)1 個月，這個時期下胚軸外植體膨大并有愈傷組織生長，將直徑1～2 cm 的愈傷組織轉(zhuǎn)入M4篩選培養(yǎng)基中二次篩選培養(yǎng)1 個月，而小于1 cm的愈傷組織再次轉(zhuǎn)入M3 篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行二次誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)1 個月，獲得的陽性愈傷組織繼代于增殖培養(yǎng)基M1 中。將增殖培養(yǎng)期間分化的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入M5 培養(yǎng)基中，記錄每個轉(zhuǎn)化體（獨(dú)立的胚性愈傷組織）的分化時間并編號，未分化的愈傷組織繼續(xù)在增殖培養(yǎng)基M1 中繼代培養(yǎng)至分化。在M3（二次誘導(dǎo)篩選）或M4（二次篩選）培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)期間有些轉(zhuǎn)化體直接在外植體上產(chǎn)生胚性愈傷組織或體細(xì)胞胚胎，這些胚性愈傷組織或體細(xì)胞胚胎不需要在M1 培養(yǎng)基中的增殖培養(yǎng)，而是直接轉(zhuǎn)入M5 培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)（這些轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的再生植株所需的分化- 再生的時間往往小于110 d）。將在150 d以內(nèi)形成的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入M5 分化培養(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)至愈傷組織分化長成胚狀體后轉(zhuǎn)入M6 培養(yǎng)基中，在M6 培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成的小植株在無菌條件下繼代轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基M7 中，繼代培養(yǎng)至小植株生長成7～9 cm 的正常再生植株后移栽或嫁接。開花期分別統(tǒng)計不同轉(zhuǎn)化體后代的不育株數(shù)，并對雄性不育株作人工輔助授粉。轉(zhuǎn)化材料不同階段繼代培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基、繼代次數(shù)及一次繼代培養(yǎng)的時間見表4。

表4 不同階段培養(yǎng)時間及繼代次數(shù)Table 4 Culturing time and subculturing times at various stages

1.2.2轉(zhuǎn)化再生植株鑒定和育性調(diào)查。選取轉(zhuǎn)基因再生株頂部幼嫩葉片，使用Promega 公司植物DNA 提取試劑盒（離心柱法）進(jìn)行DNA 提取。用Nanodrop 分光光度計2000/2000C 進(jìn)行DNA 濃度檢測，將DNA 稀釋成100 μg·L—1作為PCR 的模板。PCR 反應(yīng)體系：10 μL PCR 緩沖液、0.5 μL DNA 模板、1.0 μL 引物和ddH2O 混合成20 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。6 個載體的陽性植株P(guān)CR 鑒定所用引物序列見表3。對獲得的陽性再生植株分別進(jìn)行育性調(diào)查和統(tǒng)計分析，其中再生植株不育率（%）＝（某載體轉(zhuǎn)基因T0不育株數(shù)/ 某載體轉(zhuǎn)基因T0總株數(shù)）×100。

定義嫁接獲得的再生植株全部可育的轉(zhuǎn)化體為可育轉(zhuǎn)化體，再生植株全部不可育的轉(zhuǎn)化體為不育轉(zhuǎn)化體，部分再生植株可育的轉(zhuǎn)化體為混合轉(zhuǎn)化體。統(tǒng)計分析同一載體的轉(zhuǎn)化體育性差異，轉(zhuǎn)化體不育率的計算公式：轉(zhuǎn)化體不育率（%）＝[不育轉(zhuǎn)化體數(shù)/（不育轉(zhuǎn)化體數(shù)＋可育轉(zhuǎn)化體數(shù)＋混合轉(zhuǎn)化體數(shù)）]×100。

1.2.3愈傷組織增殖階段的組培時間對再生植株育性的影響。記錄每個載體的轉(zhuǎn)化時間和出愈時間以及每個轉(zhuǎn)化體的分化時間、見苗時間、轉(zhuǎn)基因植株的嫁接時間。將出愈-分化的時間分為90 d 以內(nèi)、90～110 d、110～130 d、130～150 d 和150 d 以上5 個時間段，分別統(tǒng)計相應(yīng)的轉(zhuǎn)化體數(shù)目。對每個轉(zhuǎn)化體獲得的陽性再生植株的育性分別進(jìn)行統(tǒng)計，分析將轉(zhuǎn)化體的分化-再生時間控制在170 d 以內(nèi)的條件下愈傷組織增殖階段的組培時間對再生植株育性的影響。

1.2.4胚性愈傷組織分化至再生培養(yǎng)時間對再生植株育性的影響。記錄每個轉(zhuǎn)化體的見苗時間，并將分化-再生時間段分為110 d 以內(nèi)、110～130 d、130～150 d、150～170 d 和170 d 以上5 個時間段，分析轉(zhuǎn)化體的出愈- 分化時間控制在150 d 以內(nèi)的條件下胚性愈傷組織分化- 再生植株培養(yǎng)時間對再生株育性的影響。

1.3 數(shù)據(jù)分析

棉花遺傳轉(zhuǎn)化組織培養(yǎng)到植株再生等試驗(yàn)處理均為3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)由Microsoft Excel 2018應(yīng)用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理（不育率在顯著性檢驗(yàn)時進(jìn)行了sin-1轉(zhuǎn)換），然后使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行方差分析，用Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因棉花再生植株不育性的表型

對轉(zhuǎn)基因棉花再生不育植株進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不育植株表現(xiàn)為雌性不育、雄性不育和雌雄不育3 種。正常情況下，棉花現(xiàn)蕾后30 d 左右花器各部分發(fā)育成熟，發(fā)育正常的花在開花前一天的下午，花冠急劇生長，露出苞葉頂部，次日上午7—9時花冠張開，花藥開裂并散出花粉（圖1A）。而雄性不育為花藥無花粉（圖1B），或柱頭高出花藥許多而無法接受花粉（圖1C）；雌性不育一般為花柱異常，無法接受花粉完成受精，即使人工授粉也不能結(jié)實(shí)（圖1D）；雌雄不育的一般有花蕾，不開花，花蕾生長一段時間脫落（圖1E）；或者無花蕊等（圖1F）。

圖1 轉(zhuǎn)基因棉花再生植株不育性表型Fig.1 Various sterility phenotypes of transgenic regenerated plants

2.2 不同載體的轉(zhuǎn)基因再生植株育性結(jié)果分析

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將6 個植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到棉花植株，從轉(zhuǎn)化外植體到獲得正常的轉(zhuǎn)基因再生株需要8～16 個月；3 次重復(fù)共獲得1 078多個再生植株，3 次重復(fù)分別獲得418、376、284株再生植株，通過PCR 篩查，3 個重復(fù)平均有262.4 株為轉(zhuǎn)基因植株，開花期對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行育性調(diào)查和鑒定，結(jié)果顯示平均有105.7 株不育（表5）。L47 載體全長18.8 kb（表4），目的基因?yàn)?.1 kb，在6 個載體中最大，其不育率36.81%，在6 個載體中居第4 位。其他5 個植物表達(dá)載體均為pCAMBIA2300，插入的目的基因大小為0.9～3.8 kb，最終構(gòu)建的載體大小為10.8～15.9 kb，相應(yīng)轉(zhuǎn)基因植株的不育率為26.20%～64.59%，差異顯著，其中L79 和L80 載體和目的基因大小相近，但轉(zhuǎn)基因再生植株不育率差異顯著，L79 不育率為26.20%，L80 不育率高達(dá)40.09%。L74 與L77、L78 載體和基因大小相近，其轉(zhuǎn)基因植株不育率也呈現(xiàn)差異顯著。綜上，轉(zhuǎn)基因再生植株育性與載體大小、目的基因或片段大小可能不存在相關(guān)性，這暗示不同載體轉(zhuǎn)化植株的不育率間的顯著差異可能來自于其它影響因子。

表5 不同載體轉(zhuǎn)化再生植株育性Table 5Fertility analysis of various transgenic regenerated plants from 6 vectors

2.3 不同轉(zhuǎn)化體之間育性分析

每個轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的再生植株數(shù)不等，有些轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的再生植株全部可育為可育轉(zhuǎn)化體，有些全部不育為完全不育轉(zhuǎn)化體，有些是部分再生植株可育部分不育的混合轉(zhuǎn)化體。如表6 所示，6個載體共計形成125.3 個轉(zhuǎn)化體，41.5 個完全不育轉(zhuǎn)化體，58.6 個可育轉(zhuǎn)化體，25.2 個混合轉(zhuǎn)化體，混合轉(zhuǎn)化體視為可育轉(zhuǎn)化體，L80 載體轉(zhuǎn)化體不育率最低（26.48%），其次是L74 載體（31.70%），不育率最高的是L77 載體（55.97%）；不同載體轉(zhuǎn)化體的不育率呈顯著差異。同時也觀察到，同一載體不同轉(zhuǎn)化體之間的育性也不同，尤其是混合轉(zhuǎn)化體前期產(chǎn)生的再生植株可育，后期形成的再生植株不育，猜測再生植株的育性可能與繼代培養(yǎng)時間有關(guān)。

表6 6 個載體轉(zhuǎn)化體育性分析Table 6 Fertility analysis of transformant from 6 vectors

2.4 組織培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)基因植株育性影響分析

分析2 個階段培養(yǎng)持續(xù)時間對各個轉(zhuǎn)化體不育株的影響發(fā)現(xiàn)：出愈-分化的5 個時間段的轉(zhuǎn)基因再生株不育率在41.6%～51.2%之間，但是不同持續(xù)時間之間的的不育率差異不顯著。不育率并沒有隨著出愈- 分化時間的延長而增加（圖2），兩者的相關(guān)系數(shù)R2僅為0.002 5，表明轉(zhuǎn)基因再生植株的不育性與出愈-分化時間的長短沒有相關(guān)性。

圖2 出愈到分化不同持續(xù)時間的轉(zhuǎn)基因植株不育率Fig.2 Sterility analysis of transgenic plants with different durations from calli emerging to embryogenesis

在本次試驗(yàn)條件下，很少的胚性愈傷組織從分化后能很快進(jìn)行再生（＜90 d），大部分胚性愈傷組織從分化到形成再生植株需110～170 d，少部分需170～190 d 獲得轉(zhuǎn)基因再生株，對分化-再生不同培養(yǎng)時間轉(zhuǎn)基因再生植株的不育率進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)：分化-再生持續(xù)不同時間的再生植株的不育率存在著顯著差異，且再生植株不育率與分化- 再生時間顯著正相關(guān)（R2為0.98），轉(zhuǎn)基因再生植株不育率隨著分化-再生時間的延長而上升（圖3）。當(dāng)分化- 再生的持續(xù)培養(yǎng)時間小于110 d，轉(zhuǎn)基因再生植株的不育率僅為19.6%，胚性愈傷組織分化-再生培養(yǎng)110～130d，130～150 d，150～170 d 的再生植株不育率分別為45.5%、63.8%、72.3%，當(dāng)分化- 再生培養(yǎng)時間在170 d 以上時，轉(zhuǎn)基因再生植株幾乎全為不育株，不育率達(dá)94.5%。

圖3 胚性愈傷組織分化到植株再生培養(yǎng)不同持續(xù)時間轉(zhuǎn)基因植株不育性Fig.3 Sterility rate of transgenic plants with different durations from embryogenesis to regenerating plantlets

3 討論

棉花轉(zhuǎn)基因再生植株不育率高已經(jīng)嚴(yán)重影響棉花功能基因鑒定和生物技術(shù)的發(fā)展，對其產(chǎn)生的原因雖有一些相關(guān)報道[6-7,13]，但是影響其發(fā)生的因素有待進(jìn)一步分析。本研究結(jié)果表明棉花轉(zhuǎn)基因再生植株不育率在不同轉(zhuǎn)化載體之間存在顯著差異，但不同載體或插入片段大小與植株不育率沒有明顯的相關(guān)關(guān)系。此外，不同載體所形成的轉(zhuǎn)化體數(shù)目不同，其原因首先是轉(zhuǎn)化親本單株個體之間體細(xì)胞再生能力有差異，其次是受侵染的下胚軸切段來自下胚軸不同的部位，而不同部位的體細(xì)胞其再生能力也有差異。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織從分化到再生植株的時間長短顯著影響不育率，而愈傷組織誘導(dǎo)到胚性愈傷組織分化時間長短對不育率無顯著影響。前期研究發(fā)現(xiàn)愈傷組織增殖培養(yǎng)階段時間的長短與T0再生植株育性之間沒有相關(guān)性，長期繼代胚性愈傷組織導(dǎo)致再生植株的不育率大幅度提高，達(dá)極顯著的相關(guān)關(guān)系[17]，本研究再次證明了這一點(diǎn)，當(dāng)分化-再生植株的培養(yǎng)時間超過170 d 時，其轉(zhuǎn)基因再生植株不育率達(dá)到94.5%以上。分化時間對再生植株不育率產(chǎn)生影響的可能原因是體細(xì)胞脫分化為胚性細(xì)胞后，具有胚胎分化發(fā)育能力，而胚性細(xì)胞分化發(fā)育成再生植株時間的長短影響染色體數(shù)目變異、結(jié)構(gòu)變異和基因變異[6,12]。也有報道表明，影響轉(zhuǎn)基因再生植株育性的因素很多，如目標(biāo)基因功能、T-DNA 插入位點(diǎn)、胚性愈傷組織培養(yǎng)的溫度，培養(yǎng)基的pH 等[4-5]，轉(zhuǎn)化再生植株不育的產(chǎn)生與形成是多因素共同作用的結(jié)果。改良棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系可以提高棉花轉(zhuǎn)基因再生植株的育性，如調(diào)整培養(yǎng)條件，縮短分化-再生的培養(yǎng)時間：（1）使用無激素的增殖培養(yǎng)基對誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)后的愈傷組織進(jìn)行增殖培養(yǎng)；（2）增加胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)透氣性 （使用透氣膜封口）；（3）提高分化培養(yǎng)基固化劑含量（3.5 g·L—1植物凝膠）；（4）胚狀體形成后降低培養(yǎng)基中糖含量（25 g·L—1葡萄糖）[17-20]。

4 結(jié)論

本研究對轉(zhuǎn)基因棉花再生植株育性影響因素研究：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因棉花再生植株育性與愈傷組織誘導(dǎo)形成-胚性愈傷組織分化的持續(xù)培養(yǎng)時間沒有相關(guān)性，與胚性愈傷組織分化-植株再生的持續(xù)培養(yǎng)時間呈顯著正相關(guān)，胚性愈傷組織持續(xù)培養(yǎng)時間的長短顯著地影響轉(zhuǎn)基因再生植株的育性，將胚性愈傷組織分化-植株再生的持續(xù)培養(yǎng)時間控制在110 d 以內(nèi)，轉(zhuǎn)基因再生植株不育率可降低至20%以下。