劉偉光,王艷偉,劉方舟,崔學(xué)靜,李 勇,董曉偉,李 碩,戴璐嫻,盛安康,史素芳*

(1.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬揚(yáng)州市婦幼保健院,江蘇 揚(yáng)州225000;2.邯鄲市第一醫(yī)院,河北 邯鄲056002;3.河北工程大學(xué)管理工程與商學(xué)院,河北 邯鄲056002;4.邯鄲市中心醫(yī)院,河北 邯鄲056002;5.邯鄲市第二醫(yī)院,河北 邯鄲056002;6.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院,河北 邯鄲056002)

據(jù)2020 年全球癌癥統(tǒng)計(jì),乳腺癌(breast cancer,BC)的發(fā)病人數(shù)已經(jīng)高于肺癌,占癌癥總?cè)藬?shù)的11.7%,同時(shí)發(fā)現(xiàn)在大部分國(guó)家中其發(fā)病率及死亡率位居第一[1-2]。由于乳腺癌的生物學(xué)因子多而復(fù)雜,目前最廣泛使用的臨床病理標(biāo)志物(雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長(zhǎng)因子受體2和Ki-67)已經(jīng)不足以完全評(píng)估其治療反應(yīng)、轉(zhuǎn)移模式和臨床結(jié)果[3]。Rab溶酶體相互作用蛋白樣2(RILPL2)是一種含有與Rab溶酶體相互作用蛋白(RILP)相似結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。已有實(shí)驗(yàn)表明,RILPL2可能在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)中起關(guān)鍵作用,并與該類(lèi)患者的預(yù)后密切相關(guān)[4]。本研究檢測(cè)RILPL2在乳腺癌組織和癌旁正常組織的陽(yáng)性表達(dá)率及表達(dá)水平,分析其與乳腺癌患者的臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1患者一般資料 收集2021年1月至12月期間河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺科90例經(jīng)病理證實(shí)的單側(cè)乳腺癌患者。患者年齡33～55歲,中位年齡44歲,均為女性。所有患者隨訪資料完整,術(shù)前均沒(méi)有放療、化療等抗腫瘤相關(guān)的治療史;術(shù)后均行蒽環(huán)類(lèi)藥物治療,然后行紫杉類(lèi)藥物化療。該研究依據(jù)《赫爾辛基宣言》進(jìn)行,同時(shí)得到了河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)同意。

1.1.2組織標(biāo)本收集 每例患者同時(shí)取乳腺癌組織和癌旁正常組織;癌旁正常組織均距癌組織 5 cm以上,經(jīng)病理證實(shí)無(wú)癌細(xì)胞。

1.1.3主要試劑 組織免疫化學(xué)染色(SP 法)試劑盒、二硝基聯(lián)苯胺( DAB) 染色劑、RILPL2蛋白第一抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物公司;組織蛋白裂解液、聚偏氟乙烯膜均購(gòu)自山東亞亨生物公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法 所有手術(shù)切除標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林液固定,常規(guī)石蠟包埋后行4 μm 連續(xù)切片。染色方法與步驟按免疫組織化學(xué)(SP 法)試劑盒內(nèi)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用RILPL2蛋白第一抗體(稀釋1:300)對(duì)乳腺癌組織和癌旁正常組織分別進(jìn)行染色和觀察,分析由兩名獨(dú)立的病理學(xué)家進(jìn)行分析和判定。

1.2.2結(jié)果分析與判定 RILPL2的陽(yáng)性染色位于細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)。采用半定量計(jì)分法[5]判斷染色結(jié)果,計(jì)算組織切片中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目所占比例(≤25%計(jì)1分,26%～50%計(jì)2分,51%～75%計(jì)3分,≥76%計(jì)4分)和染色強(qiáng)度(不染色計(jì)0分,淺黃色計(jì)1分,棕黃色計(jì)2分,棕褐色計(jì)3分)的乘積。陰性(-)為<3分,弱陽(yáng)性(+)為4～6分,中陽(yáng)性(++)為7～9分,強(qiáng)陽(yáng)性(+++)為>9分。

1.2.3蛋白免疫印跡分析RILPL2在組織中的表達(dá) 收集兩種組織,并用磨漿機(jī)將其磨為勻漿。用蛋白裂解緩沖液裂解。提取組織中的總蛋白并使用蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定其濃度。將60 μg蛋白質(zhì)進(jìn)行凝膠電泳,并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上進(jìn)行免疫印跡。在室溫下,將膜封閉1 h,然后在4℃下與RILPL2蛋白第一抗體(稀釋1∶500)孵育過(guò)夜,隨后在室溫下與第二抗體孵育2 h。膜上的蛋白質(zhì)通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光后通過(guò)圖像分析儀進(jìn)行定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用t檢驗(yàn)比較其差異;計(jì)數(shù)資料以n(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)分析RILPL2與臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RILPL2在乳腺癌及癌旁正常組織中的表達(dá)

在癌旁正常組織中,RILPL2蛋白陽(yáng)性染色呈棕黃色,主要染色于乳腺腺泡細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),細(xì)胞核不被染色;在乳腺癌組織中,RILPL2蛋白陽(yáng)性染色為棕黃色,主要染色于乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜,細(xì)胞核不被染色,并且其染色明顯比癌旁正常組織淺(見(jiàn)圖1)。

圖1 RILPL2在乳腺癌及癌旁正常組織中的表達(dá)(×400)

2.2 RILPL2在乳腺癌組織和癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率比較

免疫組織化學(xué)法分析90例乳腺癌組織和癌旁正常組織中RILPL2的表達(dá),結(jié)果顯示乳腺癌組織陽(yáng)性表達(dá)率為32.22%(29/90),明顯低于癌旁正常乳腺組織中的66.7%(60/90)(χ2=21.358,P<0.01),見(jiàn)表1。

表1 RILPL2在癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

2.3 RILPL2在乳腺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)水平

采用蛋白免疫印跡法評(píng)估RILPL2蛋白在乳腺癌組織及其癌旁正常組織中的相對(duì)表達(dá)水平,如圖2所示。乳腺癌組織中RILPL2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平(0.990±0.038)明顯低于其在癌旁的正常乳腺組織的相對(duì)表達(dá)水平(0.625±0.023)(t=34.412,P<0.01)。

注:1—癌旁正常組織,2—乳腺癌組織

2.4 RILPL2與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

單因素分析顯示,RILPL2表達(dá)與患者年齡無(wú)關(guān)(χ2=0.169,P>0.05),而與患者的腫瘤大小(χ2= 62.912,P<0.01)、組織學(xué)分級(jí)(χ2=56.535,P<0.01)、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=4.632,P<0.05)有關(guān),見(jiàn)表2。

表2 RILPL2的表達(dá)與乳腺癌患者臨床病例特征的關(guān)系

3 討論

乳腺癌是發(fā)生于中老年女性的一種比較常見(jiàn)的腫瘤性疾病,尤其是絕經(jīng)后的女性[6]。近年來(lái),由于人們的生活方式及節(jié)奏的改變,此病的發(fā)病率表現(xiàn)為逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì),對(duì)女性的生活質(zhì)量和生命健康造成嚴(yán)重的影響。乳腺癌具有異質(zhì)性,這不僅體現(xiàn)在其臨床表征和病理特征的不同,而且還觀察到不同乳腺癌亞型之間表達(dá)的生物學(xué)分子不同[7-8]。普遍認(rèn)為導(dǎo)管型乳腺癌的預(yù)后優(yōu)于其他亞型,因?yàn)镠ER2和TNBC亞型經(jīng)過(guò)治療后往往容易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[9-10]。因此,探索并充分了解乳腺癌的分子亞型或生物分子標(biāo)志物對(duì)治療方案的選擇起關(guān)鍵作用。

Rab溶酶體相互作用蛋白樣2基因編碼一種與RILP相似的含有Rab溶酶體相互作用蛋白樣結(jié)構(gòu)域。Rab7/Rab34復(fù)合體的形成促進(jìn)RILP和動(dòng)力蛋白-動(dòng)態(tài)蛋白之間的相互作用,以引導(dǎo)晚期內(nèi)體和溶酶體向微管運(yùn)動(dòng)[11]。與RILP不同,RILPL2不包括Rab7鏈接區(qū),此鏈接區(qū)阻止溶酶體隔室異位表達(dá)[12]。盡管RILPL2不影響溶酶體的運(yùn)輸,由于其與活化的Rab34和Rab36相互作用,故它仍可能作為功能性Rab效應(yīng)器[13-14]。LISE等[15]使用減少RILPL2突變或抑制MyoVa功能來(lái)表明RILPL2-MyoVa相互作用破壞抑制RILPL2的活性和隨后Rac1的激活。因此,MyoVa介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)RILPL2在神經(jīng)元調(diào)節(jié)中的功能很重要。此外,先前的研究表明,RILPL2在病毒復(fù)制中發(fā)揮作用,可作為丙型肝炎病毒(HCV)治療乳腺癌的潛在靶點(diǎn)[16]。

文獻(xiàn)研究表明,RILPL2在機(jī)體多種組織中均有表達(dá),其中包括大腦、心臟、肺臟、肝臟、腎臟、胰腺和胎盤(pán)等組織[12]。實(shí)驗(yàn)研究顯示,RILPL2在子宮內(nèi)膜癌組織中呈低表達(dá),并且其表達(dá)水平與患者的預(yù)后顯著相關(guān),即表達(dá)水平升高的患者預(yù)后較好[17]。因此,RILPL2可以作為判斷子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的生物分子標(biāo)志物。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,RILPL2在乳腺癌組織中呈低表達(dá),而在癌旁正常組織中呈高表達(dá);其在乳腺癌組織陽(yáng)性表達(dá)率、表達(dá)水平明顯低于癌旁正常乳腺組織;RILPL2表達(dá)與患者年齡無(wú)關(guān),而與患者的腫瘤分期、組織學(xué)分級(jí)、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此,這說(shuō)明RILPL2可能作為一種新的評(píng)估乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的生物標(biāo)志分子并指導(dǎo)乳腺癌精準(zhǔn)治療,然而RILPL2與其他病理標(biāo)志物的相關(guān)性需待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。