TIA人群中ApoE、MTHFR基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈斑塊的相關(guān)性分析

郝萍萍,郭 倩,黃煜森,李帥紅,方 樂*

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.神經(jīng)內(nèi)科;2.疼痛科,吉林 長(zhǎng)春130033)

短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚,研究顯示TIA患者早期卒中風(fēng)險(xiǎn)很高,頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊及其導(dǎo)致的顱外段血管狹窄是TIA發(fā)病的重要原因之一[1]。既往研究表明,基因多態(tài)性在頸動(dòng)脈粥樣硬化過程中發(fā)揮著重要作用[2]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)ApoE、MTHFR基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈斑塊的相關(guān)研究仍存在爭(zhēng)議[3-5]。本研究旨在通過探討首發(fā)頸內(nèi)動(dòng)脈系統(tǒng)TIA人群中這兩種基因型與頸動(dòng)脈斑塊的相關(guān)性,為指導(dǎo)臨床預(yù)防及治療頸動(dòng)脈粥樣硬化和TIA提供理論依據(jù),從而減少TIA及腦梗死的發(fā)病率。

1 資料與方法

1.1 病例來(lái)源

選取2020年10月至2022年10月就診于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的首發(fā)頸內(nèi)動(dòng)脈系統(tǒng)TIA人群198例。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡35～85歲,能配合要求完成檢查者;②符合頸內(nèi)動(dòng)脈系統(tǒng)TIA診斷標(biāo)準(zhǔn),頭顱CT確診無(wú)腦梗死及腦出血;③臨床資料完整。

排除標(biāo)準(zhǔn):①房顫、偏頭痛、梅尼埃病等;②肝、腎功能不全,內(nèi)分泌紊亂,家族性高脂血癥等;③近期有服用葉酸及B族維生素藥物者;④正在服用調(diào)脂藥物者;⑤臨床資料不完整者。

1.3 病例分組

所有患者統(tǒng)一由醫(yī)院超聲科完善頸動(dòng)脈超聲檢查:頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度(IMT)>1.5 mm納入斑塊組;IMT≤1.5 mm,納入無(wú)斑塊組。等回聲、鈣化、強(qiáng)回聲視為非易損斑塊,脂質(zhì)含量低、回聲不均勻的混合斑塊視為易損性斑塊。如被檢者既存在易損斑塊又有非易損斑塊,歸類于易損斑塊組。根據(jù)頸動(dòng)脈彩超結(jié)果將患者分為無(wú)斑塊組(19人)、非易損斑塊組(44人)、易損斑塊組(135人)。

1.4 ApoE、MTHFR C677T基因多態(tài)性測(cè)定

從肘靜脈抽取外周血(2 ml),放入含乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管中,使用商業(yè)分離試劑盒從外周血中提取基因組DNA并分裝,在-20℃下保存。PCR引物設(shè)計(jì):采用Premier5.0軟件設(shè)計(jì),引物由長(zhǎng)春迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心合成。擴(kuò)增片段大小260 bp,MTHFRC677T兩條引物序列分別為5’-TGGAAGGTGCAAGATCAGAG-3’和5’-TCACAAAGCGGAAGAATGTG-3’。ApoE兩條引物序列分別為5’-TAAGCTTGGCACGGCTGTCA-3’和5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTG-3’。PCR反應(yīng)體系為25 μL,常規(guī)配制。循環(huán)周期依次為92℃ 35 s、63℃ 45 s、74℃ 45 s,4個(gè)循環(huán)周期后74℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物由識(shí)別多態(tài)性位點(diǎn)的特異核酸內(nèi)切酶在37.5℃酶切1 h。2%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,根據(jù)電泳條帶區(qū)分基因型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

經(jīng)過Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn),入選人群的ApoE基因、MTHFR C677T基因頻率均符合遺傳平衡定律。

2 結(jié)果

2.1 無(wú)斑塊、非易損斑塊及易損斑塊組的一般資料、脂質(zhì)水平、Hcy的比較3組患者的年齡、糖尿病病史、高血壓病史、TG、總膽固醇、LDL-C、ApoE、HDL-C、Hcy水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 3組一般資料、脂質(zhì)水平、Hcy的比較

2.2 無(wú)斑塊、非易損斑塊及易損斑塊組ApoE、MTHFR C677T基因型及等位基因頻率比較3組間ApoE基因型及等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);3組間MTHFR C677T基因型及等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005),見表2。

表2 3組ApoE、MTHFR C677T基因型及等位基因頻率比較

2.3 頸動(dòng)脈斑塊易損性的二元Logistic 回歸分析將斑塊易損性作為因變量,進(jìn)行二元Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,LDL-C是頸動(dòng)脈斑塊易損性的危險(xiǎn)因素(OR值=1.741,95% CI 1.133～2.675,P<0.05);總膽固醇是頸動(dòng)脈斑塊易損性的危險(xiǎn)因素(OR值=1.805,95% CI 1.233～2.641,P<0.05);MTHFR TT基因型是頸動(dòng)脈斑塊易損性的危險(xiǎn)因素(OR值=2.885,95% CI 1.23～6.768,P<0.05);ApoEε4等位基因是頸動(dòng)脈斑塊易損性的危險(xiǎn)因素(OR值=10.491,95% CI 1.355～81.231,P<0.05),見表3。

表3 頸動(dòng)脈斑塊易損性的二元Logistic 回歸分析

3 討論

TIA是常見的腦血管病之一,特點(diǎn)為反復(fù)發(fā)作、極易進(jìn)展為腦梗死。頸動(dòng)脈粥樣硬化主要通過以下兩個(gè)方面對(duì)TIA的發(fā)生產(chǎn)生影響:頸動(dòng)脈狹窄情況、斑塊的形態(tài)和性質(zhì),而二者又相輔相成。因此對(duì)于TIA患者,早期通過頸動(dòng)脈超聲檢測(cè)其頸動(dòng)脈斑塊形成及狹窄情況,并對(duì)易損斑塊進(jìn)行及早干預(yù)及治療,能極大程度上減少TIA的再發(fā)及腦梗死的發(fā)生。

研究指出,與脂質(zhì)攝取及代謝過程相關(guān)的多種基因參與頸動(dòng)脈粥樣硬化[6]。其中,ApoE基因通過不同的結(jié)合位點(diǎn)維持脂蛋白的轉(zhuǎn)化、吸收過程,故而會(huì)對(duì)脂代謝產(chǎn)生較大的影響。國(guó)外一研究發(fā)現(xiàn)ApoE2/E3基因型者的頸動(dòng)脈IMT比ApoE3/E3基因型者更薄,斑塊更少[7]。HANON等[8]研究則發(fā)現(xiàn)ApoE2/E2基因型者相比于ApoE4/E4基因型者患頸動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)更高。一項(xiàng)韓國(guó)研究[9]認(rèn)為,ApoEε4等位基因是大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死患者復(fù)發(fā)的重要預(yù)測(cè)因子;ApoE基因不同表型與LDL-C受體的親和力不同,ε4有升高總膽固醇、LDL-C的作用,而ε2的作用反之。本研究二元Logistic回歸結(jié)果顯示ApoEε4等位基因、總膽固醇、LDL-C是頸動(dòng)脈斑塊易損性的危險(xiǎn)因素,且易損斑塊組ApoEε4等位基因的分布頻率明顯高于非易損斑塊組。ApoE影響AS易損性斑塊的可能機(jī)制為:(1)通過參與調(diào)控載脂蛋白E影響血脂代謝;(2)在炎癥反應(yīng)中可促使泡沫細(xì)胞的形成[10]。

一項(xiàng)薈萃分析指出Hcy與頸動(dòng)脈粥樣硬化也有著緊密的聯(lián)系[11]。參與Hcy代謝的酶類有很多種,其中最常見的和導(dǎo)致Hcy濃度升高的是MTHFR基因。在南亞和歐洲裔加拿大人中,血漿Hcy與MTHFR C677T基因多態(tài)性和頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度之間的關(guān)系已被證實(shí)[12]。日本的一項(xiàng)研究[13]結(jié)果證實(shí)了MTHFR基因多態(tài)性與頸總動(dòng)脈粥樣硬化之間的相關(guān)性,并提出危險(xiǎn)因素-基因相互作用加速頸總動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。本研究中回歸分析顯示,MTHFR TT基因型是頸動(dòng)脈斑塊易損性的危險(xiǎn)因素。關(guān)于MTHFR C677T基因多態(tài)性導(dǎo)致頸動(dòng)脈斑塊易損性目前機(jī)制仍不清楚,一項(xiàng)研究認(rèn)為由于MTHFR C677T基因突變導(dǎo)致血漿Hcy高濃度,在動(dòng)脈粥樣硬化過程中,Hcy通過誘導(dǎo)釋放細(xì)胞因子、炎癥細(xì)胞等破壞動(dòng)脈內(nèi)膜,還可通過拮抗一氧化氮擴(kuò)張血管,導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。此外,Hcy還可通過氧化應(yīng)激反應(yīng)氧化LDL-C和斑塊的其他成分,導(dǎo)致斑塊破裂、脫落風(fēng)險(xiǎn)增加[14]。