何占彪,王睿君

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 放療科,內(nèi)蒙古 呼和浩特010050;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,內(nèi)蒙古 呼和浩特010050)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma,GBM)是膠質(zhì)瘤中惡性程度最高的腫瘤,呈浸潤性生長,生長速度極快[1]。GBM患者的預(yù)后極差,中位生存期不到1.5年,5年生存率低于10%[2]。微小RNA(miRNA)是一類高度保守的編碼小分子,通過miR-RISC復(fù)合物靶向mRNA的3’非翻譯區(qū)(UTR)的結(jié)合,從而抑制靶基因表達(dá)而發(fā)揮生物學(xué)功能[3]。異常表達(dá)miRNAs影響細(xì)胞增殖、凋亡和癌癥進(jìn)展。多項(xiàng)研究證實(shí)miRNAs可以作為癌癥診斷、預(yù)后的標(biāo)志物和治療的靶點(diǎn)[4-5]。據(jù)報(bào)道在GBM患者中存在大量的miRNA異常表達(dá),與GBM患者的預(yù)后,分期及細(xì)胞增殖相關(guān)[6]。本研究分析miR-544在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá),探究其對(duì)U87細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期分布的影響,報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

收集2021年1月至2022年1月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科經(jīng)病理證實(shí)的20例GBM患者手術(shù)切除的癌組織和癌旁組織樣本共20對(duì)。手術(shù)切除后立即將樣本放入液氮中,儲(chǔ)存在-80℃冰箱中。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

人神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞T98G、U138、U87和正常膠質(zhì)細(xì)胞NHAs(上海細(xì)胞研究所,中國);DMEM培養(yǎng)基(Gibco,美國);胎牛血清(FBS,Gibco,美國);miR-544 mimics和陰性對(duì)照組(NC),pcDNA3.1-DUSP(雙特異性磷酸酶)13重組過表達(dá)質(zhì)粒和對(duì)照空載體由上海吉馬生物公司合成。TRIzol試劑( Invitrogen,美國);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas,德國);SYBR Green Master Mix(Life Technologies,CA,美國);抗體購于美國 Abcam 公司。

圖1 miR-544和DUSP在GBM患者組織和細(xì)胞中表達(dá)比較

圖3 miR-544對(duì)細(xì)胞凋亡,細(xì)胞周期分布的影響

圖4 miR-544與DUSP在神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的調(diào)控關(guān)系

圖5 過表達(dá)DUSP13對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

圖6 過表達(dá)DUSP13對(duì)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期分的影響

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

T98G、U138、U87、NHAs細(xì)胞在添加10%胎牛血清,50 U·mL-1青霉素和50 μg·mL-1鏈霉素的DMEM中保存,并在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種在6孔板中,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行接下來的實(shí)驗(yàn)。采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒將 pcDNA3.1-DUSP13重組過表達(dá)質(zhì)粒和對(duì)照空載體分別轉(zhuǎn)染到U87細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞進(jìn)行接下來的實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)

按照試劑盒使用說明,使用Trizol試劑提取RNA。用SuperScriptTMIII第一鏈合成系統(tǒng)將總mRNA(1 μg)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Green Real-time PCR Master Mixes進(jìn)行RT-qPCR,U6或GAPDH作為內(nèi)部對(duì)照。采用2-ΔΔCT方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

利用RIPA裂解緩沖液將細(xì)胞均質(zhì)化,并將50 μg的全細(xì)胞裂解物通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后用5%脫脂牛奶TBST中封閉膜1 h,然后在4℃下用所示抗體探針過夜。將HRP偶聯(lián)的山羊抗兔再培養(yǎng)1 h,用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑觀察其條帶。GAPDH作為內(nèi)參。

1.6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

CCK8測(cè)定根據(jù)試劑盒使用說明(WST-8,Dojindi Labs,Kuamoto,Japan)進(jìn)行。U87細(xì)胞以3000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板中,并用乙醇處理。24、48、72和96 h后,將10 μl CCK8溶液添加到板的每個(gè)孔中,并將孔溫育2h。使用Multiscan MS分光光度計(jì)(瑞典斯德哥爾摩Labsystems)評(píng)估450 nm處的吸光度值。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將500個(gè)對(duì)數(shù)生長階段的細(xì)胞接種到含有10 ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。細(xì)胞在37℃、5%CO2和100%濕度下生長2周,不改變培養(yǎng)基。然后,用4%多聚甲醛固定細(xì)胞,用Giemsa染色30 min,并在顯微鏡下計(jì)數(shù)菌落。

1.8 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡與周期

細(xì)胞被胰蛋白酶化,懸浮在PBS中,并在室溫下用FITC Annexin V(1∶500)染色15 min。在進(jìn)行分析之前,向細(xì)胞中加入4 μg·mL-1PI,并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡能力分析。將細(xì)胞用70%乙醇固定并重新懸浮在PBS中。隨后,將50 μg·mL-1碘化丙啶(PI)和0.2% Triton X-100添加到細(xì)胞中,在4℃下再孵育30 min,并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.9 熒光報(bào)告基因分析

合成預(yù)測(cè)靶基因的3’-UTR靶位點(diǎn)和突變體,克隆到pmirGLO雙熒光素酶miRNA靶表達(dá)載體中。U87細(xì)胞接種于96孔板,12 h后用Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染0.2 μg的質(zhì)粒、5pmol的miR-544 mimics或5pmol的scramble序列。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞,根據(jù)試劑盒使用說明書,使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析螢火蟲和海腎熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用平均值±SD,組間差異的顯著性采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-544和DUSP在GBM患者組織和細(xì)胞中表達(dá)情況

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中miR-544表達(dá)水平與癌旁組織比較顯著降低(圖1A),DUSP表達(dá)水平與癌旁組織相比顯著升高(圖1C),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G、U138、U87中miR-544表達(dá)水平與正常腦膠質(zhì)細(xì)胞NHAs相比顯著降低(P<0.05,圖1B),DUSP表達(dá)水平與NHAs相比顯著升高,(P<0.05,圖1D)。選擇表達(dá)差異較大的U87細(xì)胞進(jìn)行接下來的功能實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 過表達(dá)miR-544對(duì)U87增殖、細(xì)胞周期分布、細(xì)胞凋亡的影響

miR-544 mimics組細(xì)胞miR-544表達(dá)水平顯著高于NC組(P<0.05,圖2A),表明轉(zhuǎn)染miR-544 mimics能夠上調(diào)miR-544表達(dá)。CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果顯示:與NC組相比,miR-544 mimics組細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.05,圖2B)。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與NC組相比,miR-544 mimics組細(xì)胞克隆形成能力顯著降低(P<0.05,圖2C和2D)。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-544 mimics對(duì)細(xì)胞凋亡和周期的影響。與NC組相比,miR-544 mimics組顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(P<0.05,圖3A和3B);與NC組相比,miR-544 mimics組G1期細(xì)胞比例顯著增加,S期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05,圖3C和3D),miR-544 mimics抑制了細(xì)胞周期的進(jìn)展。

2.3 miR-544靶向調(diào)控DUSP靶基因

在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87中過表達(dá)miR-544,Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明:與對(duì)照組相比,miR-544 mimics組的DUSP表達(dá)顯著減少(見圖4A和4B)。TargetScan 預(yù)測(cè)miR-544和DUSP之間的結(jié)合位點(diǎn)(見圖4C)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)在WT組中miR-544 mimics組的熒光素酶活性顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),結(jié)果見圖4D。

2.4 過表達(dá)DUSP13可逆轉(zhuǎn)miR-544對(duì)U87細(xì)胞增殖、凋亡,周期分布的影響

過表達(dá)DUSP13組細(xì)胞DUSP13蛋白表達(dá)水平顯著高于NC組(P<0.05,圖5A),表明轉(zhuǎn)染DUSP13能夠上調(diào)DUSP13蛋白。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與miR-544 mimics組相比,miR-544 mimics+pcDNA0DUSP13組細(xì)胞增殖能力顯著增加(P<0.05,圖5B)。Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明:與miR-544 mimics組相比,miR-544 mimics+pcDNA0DUSP13組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK4、CCND1的蛋白表達(dá)水平增加,Caspase-3蛋白水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖5C和5D)。

采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DUSP13對(duì)細(xì)胞凋亡和周期的影響,與miR-544 mimics組相比,miR-544 mimics+DUSP13過表達(dá)組顯著抑制細(xì)胞凋亡(P<0.05,圖6A和6B);與miR-544 mimics組相比,miR-544 mimics+DUSP13過表達(dá)組G1期細(xì)胞比例顯著減少,S期細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05,圖6C和6D)。

3 討論

GBM是最常見的惡性腦腫瘤,盡管近年來采用多種先進(jìn)的手術(shù)治療、放療和化療等綜合治療,GBM患者的中位生存期仍約1年,預(yù)后較差。越來越多的證據(jù)表明miRNA在GBM進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[7]。研究顯示miR-595可通過靶向SOX7促進(jìn)GBM細(xì)胞增殖[8]。據(jù)報(bào)道,miR-181b與GBM進(jìn)展相關(guān)[9]。先前有研究發(fā)現(xiàn)miR-544在骨肉瘤、肝癌、胃癌和結(jié)直腸癌中發(fā)揮癌基因的功能[10-11]。然而,miR-544在乳腺癌中發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用,抑制腫瘤進(jìn)展[12]。這種功能上的差異可能具有組織特異性。本研究檢測(cè)了miR-544在GBM中的表達(dá),并鑒定了miR-544作為GBM中腫瘤抑制基因的作用。通過CCK-8、克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在GBM細(xì)胞中過表達(dá)miR-544顯著抑制了細(xì)胞的增殖,阻滯細(xì)胞周期,促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果表明miR-544在GBM中發(fā)揮腫瘤抑制作用。

miRNA通過與靶基因mRNA的3’UTR結(jié)合來調(diào)控靶基因的表達(dá),是基因表達(dá)調(diào)控的經(jīng)典方式[13]。本研究通過targetscan預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-544與DUSP13的3’UTR可能存在相互作用,并通過突變位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了miR-544與DUSP13之間的靶向結(jié)合。本研究發(fā)現(xiàn)DUSP13在GBM中表達(dá)顯著增加。miR-544與DUSP13的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。在GBM細(xì)胞中過表達(dá)DUSP13顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖,抑制凋亡。因此,DUSP13在GBM中發(fā)揮促癌基因的作用。因此,DUSP13可能是miR-544在GBM中的作用靶點(diǎn)。

DUSP是一種負(fù)責(zé)將底物上絲氨酸和酪氨酸殘基去磷酸化的蛋白家族[14]。DUSP包含DUSP1～DUSP13等家族成員,參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[15]。其中 DUSP13基因編碼兩種亞型:DUSP13B和DUSP13A。DUSP4和DUSP13的共同表達(dá)促進(jìn)了轉(zhuǎn)化生長因子β-1介導(dǎo)的肺癌的遷移、侵襲和化療耐藥[16]。功能實(shí)驗(yàn)表明,過表達(dá)miR-544顯著抑制U87細(xì)胞的增殖,阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。過表達(dá)DUSP13逆轉(zhuǎn)了miR-544對(duì)GBM細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期分布、凋亡的作用。通過熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)DUSP13是miR-544靶基因,miR-544在GBM中功能部分是通過DUSP13調(diào)控的。

本研究仍存在一些局限性。首先,未來需要研究miR-544表達(dá)的上游調(diào)控機(jī)制。其次,miR-544有很多預(yù)測(cè)的靶點(diǎn),其他靶基因是否也參與miR-544的作用尚不清楚。未來將進(jìn)一步探究miR-544及DUSP13如何在GBM進(jìn)展中發(fā)揮作用。

綜上,本研究結(jié)果揭示了MiR-544通過靶向抑制DUSP13進(jìn)而促進(jìn)GBM細(xì)胞增殖,而miR-544靶向調(diào)控DUSP13是其參與增殖過程的作用機(jī)制之一。