摘要：辣椒（Capsicum annuum L.）作為一種重要的香料和蔬菜作物，具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著辣椒的需求量逐漸增大，育種目標(biāo)也逐漸豐富，單純依靠傳統(tǒng)育種已無(wú)法滿足人們的需求。分子育種是辣椒高效育種的有效途徑，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是分子育種的核心，更是補(bǔ)充傳統(tǒng)育種和加快辣椒改良的有力工具。由于辣椒具有較高的基因型依賴性和遺傳轉(zhuǎn)化頑拗性，只采用經(jīng)典遺傳轉(zhuǎn)化策略獲取陽(yáng)性植株的概率渺茫。因此，基于經(jīng)典遺傳轉(zhuǎn)化策略的拓展或是新策略的開(kāi)發(fā)，對(duì)于推進(jìn)辣椒遺傳轉(zhuǎn)化研究十分必要。本文重點(diǎn)圍繞近5年來(lái)遺傳轉(zhuǎn)化策略的拓展開(kāi)發(fā)，從辣椒功能解析的常用手段出發(fā)，就辣椒遺傳轉(zhuǎn)化的現(xiàn)有情況、可供參考的高效轉(zhuǎn)化策略進(jìn)行綜述，并且針對(duì)辣椒遺傳轉(zhuǎn)化的難點(diǎn)總結(jié)相應(yīng)的策略，包括植物發(fā)育調(diào)節(jié)因子策略、病毒載體遞送策略、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化策略及其他物種中可供參考的轉(zhuǎn)化策略?；谝延械难芯浚雇死苯愤z傳轉(zhuǎn)化策略的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，為辣椒功能基因研究和分子育種提供理論支撐。

關(guān)鍵詞：辣椒；植物再生；遺傳轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化策略；功能驗(yàn)證

中圖分類號(hào)：S641.303" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）24-0017-06

收稿日期：2023-11-10

基金項(xiàng)目：湖南重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2023NK2006）；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào)：2023CX102）；國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：32002040）。

作者簡(jiǎn)介：張宏冠（1998—），男，山東濟(jì)寧人，碩士研究生，研究方向?yàn)槔苯贩肿釉O(shè)計(jì)育種。E-mail：871271896@qq.com。

通信作者：胡博文，博士，副教授，主要從事辣椒分子設(shè)計(jì)育種研究。E-mail：hubowen.cap@aliyun.com。

辣椒（Capsicum annuum L.）作為我國(guó)的重要蔬菜，年總產(chǎn)量可達(dá)6 400多萬(wàn)t，農(nóng)業(yè)產(chǎn)值達(dá)2 500億元，是我國(guó)經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的蔬菜，辣椒產(chǎn)業(yè)更是助農(nóng)增收、鄉(xiāng)村振興的支柱產(chǎn)業(yè)^［1］。種業(yè)是農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的 “芯片”，更是作物高產(chǎn)、高質(zhì)的重要保障^［2］。隨著環(huán)境的變化，生物與非生物脅迫嚴(yán)重限制了辣椒的產(chǎn)量與質(zhì)量，因此加強(qiáng)辣椒優(yōu)良種質(zhì)研究與創(chuàng)新已迫在眉睫^［3-4］。傳統(tǒng)的辣椒育種提高了辣椒產(chǎn)量與質(zhì)量，但選育周期長(zhǎng)、雜交不稔、遺傳性狀不穩(wěn)定等因素使得該技術(shù)存在較大的局限性，阻礙了辣椒育種的進(jìn)展，難以滿足人民的需求^［5］。分子育種為辣椒育種開(kāi)辟了一條新的道路，通過(guò)植物遺傳轉(zhuǎn)化和以此為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)提高育種效率、創(chuàng)制傳統(tǒng)育種方法難以實(shí)現(xiàn)的種質(zhì)，可為優(yōu)良品種的選育提供保障^［6-7］。

遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)和以此為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)是分子育種的關(guān)鍵，通過(guò)該項(xiàng)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的增加或改變，從而達(dá)到育種目的^［8］?，F(xiàn)如今，許多具有已知重要功能的辣椒基因，如果色相關(guān)基因、風(fēng)味相關(guān)基因、對(duì)生物脅迫與非生物脅迫的抗性基因，被分離和表征，但因遺傳轉(zhuǎn)化體系限制，包括高度再生頑固、轉(zhuǎn)化效率低等，辣椒分子育種進(jìn)程緩慢^［9-13］。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)或是以此為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)，對(duì)已定位或是克隆到的基因進(jìn)行鑒定和功能解析具有重要意義，因此高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立對(duì)于功能基因研究和分子育種更是至關(guān)重要。本文針對(duì)辣椒遺傳轉(zhuǎn)化的難點(diǎn)如再生困難、轉(zhuǎn)化效率低等問(wèn)題與相應(yīng)的解決策略進(jìn)行了綜述，并綜述了可供辣椒遺傳轉(zhuǎn)化參考的高效轉(zhuǎn)化策略，以期為辣椒高效遺傳轉(zhuǎn)化體系建立、分子育種效率提高提供理論支撐。

1 辣椒功能基因解析現(xiàn)狀

辣椒基因組的公布與泛基因組的建立為優(yōu)良基因的篩選提供了便利，隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步與成本的降低，辣椒基因被不斷預(yù)測(cè)，如抗性基因、育性基因與辣椒素合成相關(guān)基因等。然而，辣椒基因功能驗(yàn)證的方法匱乏，主要原因在于高效遺傳轉(zhuǎn)化體系在辣椒中尚未建立，雖然有成功將外源基因?qū)氲膱?bào)道，但是轉(zhuǎn)化效率低、重復(fù)性差等問(wèn)題限制了其廣泛的應(yīng)用^［14］。

目前，辣椒基因功能驗(yàn)證的方法主要集中在病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）和在其他有成熟轉(zhuǎn)化體系的物種中進(jìn)行異源超表達(dá)（表1）。這些方法有自身的局限性，如煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）在辣椒中已被用作VIGS載體，可在辣椒中誘導(dǎo)系統(tǒng)性壞死，進(jìn)而使得與防御和凋亡相關(guān)的應(yīng)答基因難以被表征，相應(yīng)的表型也難以分辨，同時(shí)，基因的異源超表達(dá)受到可轉(zhuǎn)化物種的限制，導(dǎo)致表型與預(yù)期有偏差。辣椒的遺傳轉(zhuǎn)化壁壘是研究其基因組學(xué)的嚴(yán)重限制，使其基因組學(xué)研究落后于其他茄科植物^{［9，29］} 。

2 辣椒遺傳轉(zhuǎn)化現(xiàn)狀

2.1 植物發(fā)育調(diào)節(jié)因子促進(jìn)辣椒再生

植物的離體再生能力制約了高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，常規(guī)的植物轉(zhuǎn)化需要優(yōu)化外部因素，如選擇特定的植物基因型、調(diào)整植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑比例 （主要是調(diào)整合適的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素比例，用于改變植物生長(zhǎng)）。植物發(fā)育調(diào)節(jié)因子，如Baby boom（BBM）、Wuschel（WUS）、PLETHORA（PLT）、GROWTH-REGULATING FACTOR4-GRF INTERACTING FACTOR1（GRF4-GIF1）、Wuschel-related homeobox（WOX），參與了生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的合成途徑，調(diào)控植物的再生過(guò)程，現(xiàn)已被證明能促進(jìn)植物高效遺傳轉(zhuǎn)化并擴(kuò)大可轉(zhuǎn)化物種和基因型的范圍^［30-33］。2016年玉米BBM與WUS2的異位共表達(dá)促進(jìn)了玉米、高粱、水稻、甘蔗體細(xì)胞胚的發(fā)生，并提高了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效率^［34］；2017年BBM與WUS2的異位共表達(dá)解決了頑拗性玉米B73的遺傳轉(zhuǎn)化問(wèn)題^［35］；2020年GRF4-GIF1融合蛋白的表達(dá)擴(kuò)大了小麥可轉(zhuǎn)化基因型的范圍，并提高了雙子葉植物柑橘的再生效率^［36］；2021年GRF4-GIF1融合蛋白通過(guò)突變mi396位點(diǎn)，在西瓜中實(shí)現(xiàn)了高效遺傳轉(zhuǎn)化^［37］；2022年TaWOX5的過(guò)表達(dá)克服了小麥遺傳轉(zhuǎn)化的基因型依賴，并實(shí)現(xiàn)了高效遺傳轉(zhuǎn)化^［38］。

辣椒具有基因型依賴和再生頑拗性，只采用經(jīng)典遺傳轉(zhuǎn)化策略獲得陽(yáng)性植株的概率渺茫，植物發(fā)育調(diào)節(jié)因子的使用是促進(jìn)辣椒高效遺傳轉(zhuǎn)化的有效途徑。2011年，Heidmann等開(kāi)發(fā)了一種經(jīng)典遺傳轉(zhuǎn)化策略結(jié)合植物發(fā)育調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)化再生系統(tǒng)，使用帶有BBM基因的根癌農(nóng)桿菌侵染甜椒子葉外植體，被轉(zhuǎn)化甜椒在含有10 μmol/L 地塞米松（DEX）、1 mg/L 噻苯?。═DZ）或10 μmol/L DEX+1 mg/L TDZ的MS培養(yǎng)基上能誘導(dǎo)出豐富的體細(xì)胞胚，最終生根并獲得完整植株^［39］。2022年，Lian等使用同樣的策略，利用PLT5基因的表達(dá)提高了辣椒遺傳轉(zhuǎn)化效率，從0提升至3.8%^［40］。

2.2 病毒遞送系統(tǒng)提高遞送效率

經(jīng)典遺傳轉(zhuǎn)化在大多數(shù)植物中的轉(zhuǎn)化效率低，其主要原因在于普通質(zhì)粒載體遞送效率低，因此如何將外源DNA高效遞送至植物體內(nèi)成為新的難題^［41］。病毒載體介導(dǎo)的遞送系統(tǒng)是一條有效途徑，病毒載體的遞送效率高，且具有靶向性和廣適性，是基于各種宿主植物研究基因功能的有利工具。病毒誘導(dǎo)的基因編輯（virus induced genome editing，VIGE）和病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）已經(jīng)發(fā)展成為許多轉(zhuǎn)化困難物種中基因功能驗(yàn)證的重要方法，其中最值得關(guān)注的就是VIGE^［42-43］。2015年，甘藍(lán)曲葉病毒（cabbage leaf curl virus，CaLCuV）通過(guò)VIGE技術(shù)系統(tǒng)感染了煙草，并編輯掉了八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，PDS），新生葉產(chǎn)生了漂白表型^［44］。2017年，小麥矮病毒（wheat dwarf virus，WDV）VIGE遞送系統(tǒng)被開(kāi)發(fā)，對(duì)水稻進(jìn)行了高效基因編輯^［45］ 。值得注意的是，一些陽(yáng)性RNA病毒，如煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）可以將sgRNA傳遞到生殖細(xì)胞或是分生組織中^［46］。2020年，TRV-VIGE遞送系統(tǒng)被開(kāi)發(fā)，在煙草中實(shí)現(xiàn)了高效基因編輯和穩(wěn)定遺傳，在被病毒感染的植物后代中有30%在三靶中檢測(cè)到突變^［47］。同年，苦苣菜黃網(wǎng)病毒（sonchus yellow net virus，SYNV）VIGE遞送系統(tǒng)被開(kāi)發(fā)，在煙草中實(shí)現(xiàn)高效基因編輯并且實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定遺傳，在被感染病毒的植物后代中有57%存在突變，并且可繞過(guò)組織培養(yǎng)，進(jìn)行穩(wěn)定的機(jī)械傳播^［48］。

辣椒尚未建立高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，導(dǎo)入或編輯基因的手段仍然局限于經(jīng)典遺傳轉(zhuǎn)化，高效轉(zhuǎn)化對(duì)于研究辣椒功能基因意義重大，基于病毒高效遞送系統(tǒng)，繞過(guò)經(jīng)典遺傳轉(zhuǎn)化的復(fù)雜操作從而提升轉(zhuǎn)化效率，對(duì)加速辣椒分子設(shè)計(jì)育種及創(chuàng)制優(yōu)良品種至關(guān)重要。2023年，番茄斑點(diǎn)枯萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）VIGE高效遞送系統(tǒng)被開(kāi)發(fā)，該系統(tǒng)具有宿主范圍廣、攜帶容量大且能夠進(jìn)行系統(tǒng)性感染等特點(diǎn)，對(duì)于一些難以轉(zhuǎn)化的植物來(lái)說(shuō)，TSWV克服了基因遞送效率與基因型依賴的瓶頸，TSWV系統(tǒng)性地感染了辣椒的多種基因型，并且實(shí)現(xiàn)了40%的編輯效率^［49］。TSWV在辣椒中克服了基因遞送瓶頸問(wèn)題，但仍然存在一定的局限性，如無(wú)法感染到生殖細(xì)胞、難以繞過(guò)離體再生，目前，VIGS仍是辣椒研究功能基因組學(xué)的常用技術(shù)。TRV介導(dǎo)的VIGS技術(shù)常用于辣椒中，但是沉默效率不穩(wěn)定，仍需要被進(jìn)一步優(yōu)化。2021年，帶有C2b基因的TRV載體被開(kāi)發(fā)，TRV感染后 5個(gè)辣椒品種果實(shí)表型明顯，隨后的定量數(shù)據(jù)證明了基因沉默的高效性，TRV-C2b為VIGS技術(shù)提供了高效的載體，并有助于辣椒整個(gè)生命周期的基因功能研究^［50］。接種TRV病毒后表現(xiàn)出的癥狀，如壞死、變黃、發(fā)育遲緩，可能會(huì)影響辣椒基因功能的系統(tǒng)分析^［51］，因此，蠶豆萎蔫病毒2號(hào)（broad bean wilt virus 2，BBWV2）被開(kāi)發(fā)，BBWV2病毒載體介導(dǎo)的VIGS不會(huì)引起辣椒明顯的病毒癥狀，且BBWV2與異源病毒抑制子共表達(dá)，增強(qiáng)了重組蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性^［15］。

2.3 辣椒原生質(zhì)體遞送系統(tǒng)被開(kāi)發(fā)

許多植物因遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)壁壘阻礙了其分子機(jī)理的研究，因此，一種分析分子過(guò)程的材料需要被開(kāi)發(fā)。使用原生質(zhì)體被認(rèn)為是一種簡(jiǎn)便有效的辦法，因其沒(méi)有細(xì)胞壁且易吸收外源物質(zhì)被廣泛用于遺傳轉(zhuǎn)化和以此為基礎(chǔ)的基因編輯^［52-53］，同時(shí)具有試驗(yàn)周期短、轉(zhuǎn)化效率高、脫靶率低的優(yōu)勢(shì)^［54-55］。在植物進(jìn)行基因編輯之前，使用原生質(zhì)體通過(guò)核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）遞送系統(tǒng)來(lái)確定目標(biāo)基因的編輯效率，對(duì)于建立了再生系統(tǒng)的植物可以進(jìn)一步產(chǎn)生基因編輯植物。2020年，使用RNP遞送系統(tǒng)對(duì)橡膠樹(shù)原生質(zhì)體完成了基因編輯，編輯效率為70%^［56］。2021年，使用RNP遞送系統(tǒng)對(duì)輻射松原生質(zhì)體完成了基因編輯，隨后使用被編輯后的原生質(zhì)體產(chǎn)生了再生苗^［57］。2023年，使用RNP遞送系統(tǒng)對(duì)葡萄原生質(zhì)體進(jìn)行了基因編輯，隨后通過(guò)體細(xì)胞胚的發(fā)生途徑獲得了被編輯后的完整植株^［58］。

辣椒遺傳轉(zhuǎn)化困難，以此為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)在之前未曾被報(bào)道，近幾年有了突破。2020年，使用RNP遞送系統(tǒng)對(duì)辣椒原生質(zhì)體進(jìn)行了基因編輯，并獲得了19.3%的編輯效率，為辣椒創(chuàng)制了首個(gè)基因編輯系統(tǒng)^［59］。然而，辣椒原生質(zhì)體的再生系統(tǒng)尚未被報(bào)道，如何獲得再生植株仍需進(jìn)一步的探索。

3 高效轉(zhuǎn)化策略為提升辣椒遺傳轉(zhuǎn)化效率提供參考

3.1 可移動(dòng)RNA的應(yīng)用

載體遞送效率低與轉(zhuǎn)化后再生困難是辣椒遺傳轉(zhuǎn)化的重要限制因素^［9］。病毒遞送系統(tǒng)的使用、植物發(fā)育調(diào)節(jié)因子共表達(dá)有效地解決了這些困難，但是這些方法仍不夠完善，如病毒遞送系統(tǒng)無(wú)法侵染到生殖器官，陽(yáng)性苗的獲得繞不開(kāi)組織培養(yǎng)；植物發(fā)育調(diào)節(jié)因子WUS、BBM過(guò)表達(dá)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物表型出了異常的表型，如根尖卷曲、葉片扭曲或是下胚軸膨脹等^［60］。因此，辣椒遺傳轉(zhuǎn)化策略開(kāi)發(fā)工作依舊充滿挑戰(zhàn)。

盡管有新策略被開(kāi)發(fā)，辣椒遺傳轉(zhuǎn)化仍然受限于組織培養(yǎng)，近幾年其他物種的轉(zhuǎn)化策略為辣椒遺傳轉(zhuǎn)化提供了參考（圖1）。2023年，一種基于tRNA-like sequence（TLS）的基因編輯傳遞方法被開(kāi)發(fā)，該方法使用砧木嫁接法將可移動(dòng)的TLS從轉(zhuǎn)基因供體轉(zhuǎn)移到兼容的野生型受體植物中，從而在當(dāng)代獲得純合編輯的植株^［61］。這種繞過(guò)組織培養(yǎng)、省略雜交和自交步驟獲得純合編輯植株的方案，對(duì)加速優(yōu)良品種培育意義重大。2022年，番茄與辣椒嫁接關(guān)鍵調(diào)控因子WOX4被鑒定且番茄有穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體系，該研究為辣椒嫁接攜帶TLS基因編輯的番茄供體提供了可能^［62］。

3.2 葉綠體轉(zhuǎn)化體系的應(yīng)用

葉綠體轉(zhuǎn)化與主流的核轉(zhuǎn)化相比具有外源基因表達(dá)量高、無(wú)位置效應(yīng)、無(wú)花粉漂移、有多基因共表達(dá)元件等優(yōu)勢(shì)^［63］。2019年，一種具有廣適性的葉綠體轉(zhuǎn)化方法被開(kāi)發(fā)，該方法使用納米顆粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)化植物，研究人員在葉片表面下方使用注射法將顆粒通過(guò)氣孔注入葉片，進(jìn)入葉片內(nèi)部后，納米顆粒會(huì)穿過(guò)細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，最終穿過(guò)葉綠體的雙層膜，進(jìn)入葉綠體后，葉綠體的弱酸性環(huán)境會(huì)促使 DNA從納米顆粒中釋放出來(lái)。隨后，研究人員在菠菜、煙草、芝麻和擬南芥中進(jìn)行了測(cè)試，利用黃色熒光蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，47%的植物細(xì)胞可表達(dá)黃色熒光蛋白^［64］。在高等植物中，茄科植物是進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)化成功最多的，且該方案不需要組織培養(yǎng)，該研究為辣椒遺傳轉(zhuǎn)化新策略開(kāi)發(fā)提供了參考^［65］。

4 展望

目前辣椒基因功能驗(yàn)證的手段多為VIGS或是異源超表達(dá)，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化手段的報(bào)道較少，近幾年新開(kāi)發(fā)的轉(zhuǎn)化策略對(duì)辣椒基因組學(xué)研究、優(yōu)良品種培育有巨大的價(jià)值，綜合已有的研究，未來(lái)的研究可以在以下4個(gè)方面進(jìn)一步延伸：（1）植物發(fā)育調(diào)節(jié)因子組合使用可能會(huì)有累加的作用進(jìn)而促進(jìn)外植體再生，如GRF-GIF促進(jìn)單子葉與雙子葉植物的再生、BBM-WUS促進(jìn)單子葉植物體細(xì)胞胚發(fā)生^{［36，40］} 。因此，可以利用多組學(xué)聯(lián)合分析技術(shù)進(jìn)一步挖掘與植物再生相關(guān)的基因，并單獨(dú)或組合測(cè)試其在辣椒中的轉(zhuǎn)化效率。（2）病毒遞送系統(tǒng)提高了辣椒的轉(zhuǎn)化，然而大多數(shù)病毒無(wú)法感染到生殖細(xì)胞或是分生組織無(wú)法穩(wěn)定遺傳至下一代，因此無(wú)法繞過(guò)組織培養(yǎng)，離體再生這一瓶頸依然存在^［49］。植物發(fā)育調(diào)節(jié)因子共接種增加了被編輯外植體再生的可能，而使用病毒遞送系統(tǒng)結(jié)合植物發(fā)育調(diào)節(jié)因子共接種，在提升遞送效率的同時(shí)增加了再生的可能性^［66］。（3）Flowering Locus T（FT） 融合sgRNA在TRV載體中被證明可移動(dòng)到頂端分生組織和花組織^［67］。這意味著通過(guò)病毒遞送系統(tǒng)，可以獲得無(wú)需組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因苗。然而病毒的容載量（通常小于1 kb）限制了基因編輯組件的遞送，如Cas9蛋白（大小為4 kb），TSWV的大容載量解決了這一問(wèn)題，因此TSWV融合可移動(dòng)RNA元件如FT，可能有助于基因編輯植物的獲得^［68］。（4）參考繞過(guò)組織培養(yǎng)的遺傳轉(zhuǎn)化策略，開(kāi)發(fā)出新的方案如TLS、葉綠體轉(zhuǎn)化等。

參考文獻(xiàn)：

［1］吳永紅，周書(shū)棟，李雪峰，等. 2019年辣椒科學(xué)研究進(jìn)展［J］. 辣椒雜志，2020，18（2）：1-7，13.

［2］林 巧，辛竹琳，孔令博，等. 我國(guó)辣椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及育種應(yīng)對(duì)措施［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2023，28（5）：82-95.

［3］Meng Y C，Zhang H F，Pan X X，et al. CaDHN3，a pepper （Capsicum annuum L.） dehydrin gene enhances the tolerance against salt and drought stresses by reducing ROS accumulation［J］. International Journal of Molecular Sciences，2021，22（6）：3205.

［4］鄒學(xué)校，馬艷青，戴雄澤，等. 辣椒在中國(guó)的傳播與產(chǎn)業(yè)發(fā)展［J］. 園藝學(xué)報(bào)，2020，47（9）：1715-1726.

［5］Martins K C，Pereira T N S，Souza S A M，et al. Crossability and evaluation of incompatibility barriers in crosses between Capsicum species［J］. Crop Breeding and Applied Biotechnology，2015，15（3）：139-145.

［6］Krishna H，Alizadeh M，Singh D，et al. Somaclonal variations and their applications in horticultural crops improvement［J］. 3 Biotech，2016，6（1）：54.

［7］Karthik S，Pavan G，Prasanth A，et al. Improved in planta genetic transformation efficiency in bitter gourd （Momordica charantia L.）［J］. In Vitro Cellular amp; Developmental Biology-Plant，2021，57（2）：190-201.

［8］張文斗，王 燕，徐 曼，等. 觀賞桃分子育種研究進(jìn)展與展望［J］. 農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2023，43（12）：56-59.

［9］Kothari S L，Joshi A，Kachhwaha S，et al. Chilli peppers：a review on tissue culture and transgenesis［J］. Biotechnology Advances，2010，28（1）：35-48.

［10］Lu B Y，Cheng G X，Zhang Z，et al. CaMYC，a novel transcription factor，regulates anthocyanin biosynthesis in color-leaved pepper （Capsicum annuum L.）［J］. Journal of Plant Growth Regulation，2019，38（2）：574-585.

［11］Taller J. Gene functioning in pepper［J］. Acta Agronomica Hungarica，2006，54（2）：233-269.

［12］Liu C Y，Peang H R，Li X Y，et al. Genome-wide analysis of NDR1/HIN1-like genes in pepper （Capsicum annuum L.） and functional characterization of CaNHL4 under biotic and abiotic stresses［J］. Horticulture Research，2020，7（1）：93.

［13］Wu D，Ni M，Lei X，et al. Analyses of pepper cinnamoyl-CoA reductase gene family and cloning of CcCCR1/2 and their function identification in the formation of pungency［J］. Horticulturae，2022，8（6）：537.

［14］Zhu Z S，Sun B M，Cai W，et al. Natural variations in the MYB transcription factor MYB31 determine the evolution of extremely pungent peppers［J］. New Phytologist，2019，223（2）：922-938.

［15］Wang Y X，Wang Z，Geng S S，et al. Identification of the GDP-L-galactose phosphorylase gene as a candidate for the regulation of ascorbic acid content in fruits of Capsicum annuum L［J］. International Journal of Molecular Sciences，2023，24（8）：7529.

［16］Zhang H F，Pei Y P，He Q，et al. Salicylic acid-related ribosomal protein CaSLP improves drought and Pst.DC3000 tolerance in pepper［J］. Molecular Horticulture，2023，3（1）：6.

［17］Zhou Y，Li Y，Yu T，et al. Characterization of the B-BOX gene family in pepper and the role of CaBBX14 in defense response against Phytophthora capsici infection［J］. International Journal of Biological Macromolecules，2023，237：124071.

［18］Li Y，Ma X，Xiao L D，et al. CaWRKY50 acts as a negative regulator in response to Colletotrichum scovillei infection in pepper［J］. Plants，2023，12（10）：1962.

［19］Mao L Z，Tian W F，Shen Y Y，et al. Auxin-related MYB （CaSRM1） is involved in leaf shape development and reproductive growth in pepper （Capsicum annuum L.）［J］. Scientia Horticulturae，2023，322：112383.

［20］Zhang L P，Wu D，Zhang W，et al. Genome-wide identification of WRKY gene family and functional characterization of CcWRKY25 in Capsicum chinense［J］. International Journal of Molecular Sciences，2023，24（14）：11389.

［21］Baek W，Bae Y，Lim C W，et al. Pepper homeobox abscisic acid signalling-related transcription factor 1，CaHAT1，plays a positive role in drought response［J］. Plant，Cell amp; Environment，2023，46（7）：2061-2077.

［22］Zhang J W，Xie M H，Yu G F，et al. CaSPDS，a spermidine synthase gene from pepper （Capsicum annuum L.），plays an important role in response to cold stress［J］. International Journal of Molecular Sciences，2023，24（5）：5013.

［23］Zhang H F，Guo J B，Chen X Q，et al. Transcription factor CabHLH035 promotes cold resistance and homeostasis of reactive oxygen species in pepper［J/OL］. Horticultural Plant Journal，2023（2023-03-16）［2023-11-10］. https：//www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468014123000468.

［24］Liu Y，Cao H Y，Ling J，et al. Molecular cloning and functional analysis of the pepper resistance gene Me3 to root-knot nematode［J］. Horticultural Plant Journal，2023，9（1）：133-144.

［25］Dong J C，Hu F，Guan W D，et al. A 163-bp insertion in the Capana10g000198 encoding a MYB transcription factor causes male sterility in pepper （Capsicum annuum L.）［J］. The Plant Journal，2023，113（3）：521-535.

［26］Ma X，Yu Y N，Li Y，et al. The CBL-interacting protein kinase CaCIPK7 enhances drought resistance in pepper［J］. Scientia Horticulturae，2023，310：111726.

［27］Hussain A，Khan M I，Albaqami M，et al. CaWRKY30 positively regulates pepper immunity by targeting CaWRKY40 against Ralstonia solanacearum inoculation through modulating defense-related genes［J］. International Journal of Molecular Sciences，2021，22（21）：12091.

［28］Liang M M，Li H Y，Yong K，et al. Pepper autophagy related gene CaATG8e differentially regulates plant tolerance to heat and salt stress［J］. Scientia Horticulturae，2023，308（3）：111559.

［29］Choi B，Kwon S J，Kim M H，et al. A plant virus-based vector system for gene function studies in pepper［J］. Plant Physiology，2019，181（3）：867-880.

［30］Gordon-Kamm B，Sardesai N，Arling M，et al. Using morphogenic genes to improve recovery and regeneration of transgenic plants［J］. Plants，2019，8（2）：38.

［31］Lee K，Wang K.Strategies for genotype-flexible plant transformation［J］. Current Opinion in Biotechnology，2023，79：102848.

［32］Nagle M，Déjardin A，Pilate G，et al. Opportunities for innovation in genetic transformation of forest trees［J］. Frontiers in Plant Science，2018，9：1443.

［33］Nalapalli S，Tunc-Ozdemir M，Sun Y J，et al. Morphogenic regulators and their application in improving plant transformation［J］. Methods in Molecular Biology，2021，2238：37-61.

［34］Lowe K，Wu E，Wang N，et al. Morphogenic regulators Baby boom and Wuschel improve monocot transformation［J］. Plant Cell，2016，28（9）：1998-2015.

［35］Mookkan M，Nelson-Vasilchik K，Hague J，et al. Selectable marker independent transformation of recalcitrant maize inbred B73 and sorghum P898012 mediated by morphogenic regulators BABY BOOM and WUSCHEL2［J］. Plant Cell Reports，2017，36（9）：1477-1491.

［36］Debernardi J M，Tricoli D M，Ercoli M F，et al. A GRF-GIF chimeric protein improves the regeneration efficiency of transgenic plants［J］. Nature Biotechnology，2020，38（11）：1274-1279.

［37］Feng Q，Xiao L，He Y Z，et al. Highly efficient，genotype-independent transformation and gene editing in watermelon （Citrullus lanatus） using a chimeric ClGRF4-GIF1 gene［J］. Journal of Integrative Plant Biology，2021，63（12）：2038-2042.

［38］Wang K，Shi L，Liang X N，et al. The gene TaWOX5 overcomes genotype dependency in wheat genetic transformation［J］. Nature Plants，2022，8（2）：110-117.

［39］Heidmann I，de Lange B，Lambalk J，et al. Efficient sweet pepper transformation mediated by the BABY BOOM transcription factor［J］. Plant Cell Reports，2011，30（6）：1107-1115.

［40］Lian Z Y，Nguyen C D，Liu L，et al. Application of developmental regulators to improve in planta or in vitro transformation in plants［J］. Plant Biotechnology Journal，2022，20（8）：1622-1635.

［41］Kausch A P，Nelson-Vasilchik K，Hague J，et al. Edit at will：genotype independent plant transformation in the era of advanced genomics and genome editing［J］. Plant Science，2019，281：186-205.

［42］Oh Y，Kim H，Kim S G.Virus-induced plant genome editing［J］. Current Opinion in Plant Biology，2021，60：101992.

［43］Rssner C，Lotz D，Becker A. VIGS goes viral：how VIGS transforms our understanding of plant science［J］. Annual Review of Plant Biology，2022，73：703-728.

［44］Yin K Q，Han T，Liu G，et al. A geminivirus-based guide RNA delivery system for CRISPR/Cas9 mediated plant genome editing［J］. Scientific Reports，2015，5：14926.

［45］Wang M G，Lu Y M，Botella J R，et al. Gene targeting by homology-directed repair in rice using a geminivirus-based CRISPR/Cas9 system［J］. Molecular Plant，2017，10（7）：1007-1010.

［46］Ali Z，Abul-faraj A，Li L X，et al. Efficient virus-mediated genome editing in plants using the CRISPR/Cas9 system［J］. Molecular Plant，2015，8（8）：1288-1291.

［47］Ellison E E，Nagalakshmi U，Gamo M E，et al. Multiplexed heritable gene editing using RNA viruses and mobile single guide RNAs［J］. Nature Plants，2020，6：620-624.

［48］Ma X N，Zhang X Y，Liu H M，et al. Highly efficient DNA-free plant genome editing using virally delivered CRISPR-Cas9［J］. Nature Plants，2020，6（7）：773-779.

［49］Liu Q，Zhao C L，Sun K，et al. Engineered biocontainable RNA virus vectors for non-transgenic genome editing across crop species and genotypes［J］. Molecular Plant，2023，16（3）：616-631.

［50］Zhou Y J，Deng Y T，Liu D，et al. Promoting virus-induced gene silencing of pepper genes by a heterologous viral silencing suppressor［J］. Plant Biotechnology Journal，2021，19（12）：2398-2400.

［51］Gleba Y，Klimyuk V，Marillonnet S.Viral vectors for the expression of proteins in plants［J］. Current Opinion in Biotechnology，2007，18（2）：134-141.

［52］Wang Y Y，Zhang Y A，Dong Y X，et al. A highly efficient mesophyll protoplast isolation and PEG-mediated transient expression system in eggplant［J］. Scientia Horticulturae，2022，304：111303.

［53］Xia K K，Zhang D W，Liu G Y，et al. Efficient multiplex genome editing tools identified by protoplast technology in Phalaenopsis［J］. Biorxiv，2020，322：111368.

［54］Naing A H，Adedeji O S，Kim C K.Protoplast technology in ornamental plants：current progress and potential applications on genetic improvement［J］. Scientia Horticulturae，2021，283：110043.

［55］Zhang Q，Xing H L，Wang Z P，et al. Potential high-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR/Cas9 in Arabidopsis and its prevention［J］. Plant Molecular Biology，2018，96（4）：445-456.

［56］Fan Y T，Xin S C，Dai X M，et al. Efficient genome editing of rubber tree （Hevea brasiliensis） protoplasts using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins［J］. Industrial Crops and Products，2020，146：112146.

［57］Poovaiah C，Phillips L，Geddes B，et al. Genome editing with CRISPR/Cas9 in Pinus radiata （D.Don）［J］. BMC Plant Biology，2021，21（1）：363.

［58］Najafi S，Bertini E，DIncà E，et al. DNA-free genome editing in grapevine using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes followed by protoplast regeneration［J］. Horticulture Research，2023，10（1）：uhac240.

［59］Kim H，Choi J，Won K H.A stable DNA-free screening system for CRISPR/RNPs-mediated gene editing in hot and sweet cultivars of

Capsicum annuum［J］. BMC Plant Biology，2020，20（1）：449.

［60］Maren N A，Duan H，Da K D，et al. Genotype-independent plant transformation［J］. Horticulture Research，2022，9：uhac047.

［61］Yang L，Machin F，Wang S F，et al. Heritable transgene-free genome editing in plants by grafting of wild-type shoots to transgenic donor rootstocks［J］. Nature Biotechnology，2023，41：958-967.

［62］Thomas H，van den Broeck L，Spurney R，et al. Gene regulatory networks for compatible versus incompatible grafts identify a role for SlWOX4 during junction formation［J］. The Plant Cell，2022，34（1）：535-556.

［63］Ruf S，F(xiàn)orner J，Hasse C，et al. High-efficiency generation of fertile transplastomic Arabidopsis plants［J］. Nature Plants，2019，5（3）：282-289.

［64］Kwak S Y，Lew T T S，Sweeney C J，et al. Chloroplast-selective gene delivery and expression in planta using chitosan-complexed single-walled carbon nanotube carriers［J］. Nature Nanotechnology，2019，14（5）：447-455.

［65］Liu Y X，Li F，Gao L，et al. Advancing approach and toolbox in optimization of chloroplast genetic transformation technology［J］. Journal of Integrative Agriculture，2023，22（7）：1951-1966.

［66］Maher M F，Nasti R A，Vollbrecht M，et al. Plant gene editing through de novo induction of meristems［J］. Nature Biotechnology，2020，38：84-89.

［67］Ellison E E，Nagalakshmi U，Gamo M E，et al. Author correction：multiplexed heritable gene editing using RNA viruses and mobile single guide RNAs［J］. Nature Plants，2021，7：99.

［68］Gao Q，Xu W Y，Yan T，et al. Rescue of a plant cytorhabdovirus as versatile expression platforms for planthopper and cereal genomic studies［J］. New Phytologist，2019，223（4）：2120-2133.