2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮誘導(dǎo)Hep3B 人肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制

劉曉冬，韓英浩

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

肝癌是我國(guó)高發(fā)的、危害極大的惡性腫瘤，其死亡率居全球癌癥死亡率第4 位[1]。肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma HCC）是最常見(jiàn)的肝癌類型，約占總病例數(shù)的90%，給我國(guó)醫(yī)療帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[2]。在中國(guó)，原發(fā)性肝臟腫瘤的發(fā)病率特別高，約占全球新增病例和死亡病例的50%。據(jù)報(bào)道，肝癌男性死亡率為37.5/100 000，女性死亡率為14.4/100 000，對(duì)人類健康和生命構(gòu)成嚴(yán)重威脅[3]。目前，肝癌的有效治療方法包括手術(shù)治療、化療和放療。然而，這些療法可能會(huì)導(dǎo)致一些副作用，如腎損傷和聽(tīng)力障礙[4]。腫瘤的基因治療發(fā)展較快，理論和技術(shù)正在成熟過(guò)程中，逐漸被患者接受，但價(jià)格昂貴，化療是化學(xué)治療的簡(jiǎn)稱，化療在腫瘤治療中的應(yīng)用最廣泛，需要提高治療效果，有效地控制擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，主要因其毒副作用，限制了臨床的使用。因此，迫切需要合成更加安全有效的新化合物，以減少HCC 在治療期間的細(xì)胞毒性。因此，設(shè)計(jì)合成高效低毒的化學(xué)治療藥物有很大的意義。

細(xì)胞凋亡是化學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的一種活性形式，其特征在于有序的細(xì)胞死亡，并由線粒體功能障礙介導(dǎo)。在癌癥治療中，細(xì)胞凋亡作為最佳的治療方法。通常來(lái)說(shuō)，有兩種蛋白參與了細(xì)胞凋亡過(guò)程，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，Bax 蛋白是活性非常強(qiáng)的一種促凋亡蛋白。如果能在癌細(xì)胞中顯著激活這一蛋白，可實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞凋亡的控制[5]。Bcl-2 是與細(xì)胞凋亡相關(guān)的癌基因，可以通過(guò)線粒體途徑參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，在許多人類腫瘤細(xì)胞中都存在過(guò)表達(dá)或異常表達(dá)的現(xiàn)象[6]。Caspase-3 也是細(xì)胞死亡機(jī)制的重要組成部分[7]。此外，細(xì)胞凋亡是從體內(nèi)去除衰老細(xì)胞的常用方法，在生物體發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。大多數(shù)抗癌療法觸發(fā)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)，并調(diào)節(jié)信號(hào)通路以消除癌細(xì)胞。線粒體在誘導(dǎo)細(xì)胞死亡信號(hào)的整合和傳遞中起重要作用。因此，抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡是很好的治療手段。

線粒體膜電位（Δμm）是線粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子分布不均所形成的電化學(xué)梯度[8]。當(dāng)細(xì)胞因線粒體損傷而誘導(dǎo)凋亡時(shí)，其膜電位已經(jīng)開(kāi)始改變，膜通透性增加，跨膜電位下降[9]。用熒光探針JC1 測(cè)定Hep3B 細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位變化，正常情況下細(xì)胞的線粒體膜電位相對(duì)較高，JC1 探針可以在線粒體基質(zhì)中進(jìn)行積累，累積后會(huì)形成化學(xué)聚合物，可以產(chǎn)生明顯的紅色熒光[10]。研究表明，線粒體損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，線粒體膜電位為細(xì)胞的健康和功能狀態(tài)提供了有價(jià)值的指標(biāo)。當(dāng)線粒體發(fā)生損傷時(shí)，線粒體膜電位下降[11]。

1，4-萘醌化合物因其潛在的生物學(xué)益處，包括抗炎和抗菌活性而被廣泛研究。此外，1，4-萘醌藥效團(tuán)表現(xiàn)出抗癌活性，并且是先前研究的焦點(diǎn)[12]。在1，4-萘醌化合物中，好多已被用于開(kāi)發(fā)有效的抗癌藥物。然而，這些化合物表現(xiàn)出高水平的細(xì)胞毒性和顯著的副作用，使得它們?cè)谂R床環(huán)境中作為抗癌藥物的應(yīng)用存在問(wèn)題[13]。為了開(kāi)發(fā)具有降低副作用和優(yōu)化抗腫瘤作用的化合物，研究設(shè)計(jì)合成了一種新的1，4-萘醌衍生物2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮，并對(duì)抗腫瘤活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，研究在人肝細(xì)胞癌（HCC）細(xì)胞Hep3B 中的細(xì)胞毒性作用、凋亡作用、線粒體損傷的潛在機(jī)制，為抗癌藥物的合成設(shè)計(jì)提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞系Hep3B，來(lái)自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院干細(xì)胞與再生生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑及儀器

1，5-二羥基萘（AR 華藍(lán)試劑），硫酸二甲酯（AR Sigma-Aldrich），N-溴代丁二酰亞胺（AR Sigma-Aldrich），甲醇鈉（AR 阿拉丁），碘化鉀（AR 華藍(lán)試劑），硝酸鈰銨（AR Sigma-Aldrich），以上各種試劑均為分析純；青霉素鏈霉素混合液（P/S）購(gòu)自北京索萊寶公司；DNEM/高糖培養(yǎng)液購(gòu)自北京索萊寶公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青公司；含EDTA 的胰蛋白酶（T/E）購(gòu)自北京索萊寶公司；細(xì)胞緩沖液（PBS）購(gòu)自美國(guó)Hyclon 公司；噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自Amresco 公司；Acrylamide、Bis-acrylamide、Tris-base（堿）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）、吐溫-20（Tween-20）、1 M Tris-HCl（pH=6.8）、1.5 M Tris-HCl（pH=8.8）、麗春紅、考馬斯亮藍(lán)等蛋白免疫印記系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；電泳槽購(gòu)自瑞典Bio-Sciences AB 公司；Western blot 轉(zhuǎn)膜桶購(gòu)自瑞典Bio-Sciences AB 公司；熒光化學(xué)成像系統(tǒng)購(gòu)自GE 公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio Tek 公司。

1.3 化合物合成

1.3.1 中間體5，8-二甲氧基-1，4-萘醌的合成

為合成DMNQ 的衍生物，試驗(yàn)以1，5-二羥基萘為原料，在25 ℃弱堿性溶液的條件下，與硫酸二甲酯進(jìn)行反應(yīng)，使羥基甲基化得到1，5-二甲氧基萘。利用N-溴代丁二酰亞胺（NBS）的自由基反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行一系列的溴化反應(yīng)，并且降低了溴化反應(yīng)試劑的毒性，最終得到4，8-二溴-1，5-二甲氧基萘。在甲醇鈉和碘化鉀的催化反應(yīng)下，并以甲醇和二甲基甲酰胺混合物為溶劑加熱回流約30 h，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，再用乙酸乙酯重結(jié)晶得1，4，5，8-四甲氧基萘，將硝酸鈰銨溶解于水中，并將其添加到含有1，4，5，8-四甲氧基萘的氯仿和乙腈的混合溶液中，并在室溫下攪拌1 h。所得有機(jī)層加入氯仿和飽和鹽水萃取，使其分離，再加入無(wú)水硫酸鈉除去其中的水分，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至殘?jiān)?。所得殘?jiān)尤爰状肌⒓訜崂鋮s，使其重結(jié)晶，生成中間體5，8-二甲氧基-1，4-萘醌（DMNQ）。

圖1 5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮（DMNQ）的合成Fig.1 Synthesis of 5，8-dimethoxynaphthalene-1，4-dione（DMNQ）

1.3.2 2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮的合成

以DMNQ 為底物，利用典型的邁克爾加成反應(yīng)得到DMNQ 衍生物2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮。

圖2 2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮的合成Fig.2 Synthesis of 2-（4-methoxy-phenylmercapto）-5，8-dimethoxynaphthalene-1，4-dione

1.4 細(xì)胞傳代培養(yǎng)

將Hep3B 細(xì)胞復(fù)蘇到6 cm 培養(yǎng)皿里，Hep3B 細(xì)胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基（DMEM）中，含有10%滅活的新生胎牛血清（FBS）和1%的抗生素（青霉素/鏈霉素），并置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，24 h 換液，48 h 傳代。

1.5 MTT 檢測(cè)細(xì)胞抑制活性

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep3B 細(xì)胞接種在96 孔板中，傳代時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)孔接種5 000 個(gè)細(xì)胞，并放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出96 孔板，將上清液棄掉，加入含有1% FBS 的饑餓培養(yǎng)液處理2 h，棄去饑餓的培養(yǎng)液，在試驗(yàn)組分別加入1 μL 化合物溶液（化合物的終末濃度分別為0.3，1，3，10 μmol·L-1），對(duì)照組加入1 μL DMSO 對(duì)照液。藥物處理采用5 個(gè)濃度梯度，4 個(gè)復(fù)孔，溶劑對(duì)照也為4 個(gè)復(fù)孔?；衔锾幚砼囵B(yǎng)24 h 后，取出96 孔板，在每個(gè)孔中加入10 μL 的MTT 染液，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)處理培養(yǎng)2 h，棄去上清，每孔加入100 μL 二甲基亞砜溶液，放入培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)10 min 后，拿出并包上錫紙避光。用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD 值，檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm，導(dǎo)出數(shù)據(jù)，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率，并計(jì)算半數(shù)致死濃度。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡分析

將細(xì)胞接種于2 個(gè)6 cm 培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿接種8 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，試驗(yàn)組加入50 μL 化合物溶液（3 μmol·L-1），放入培養(yǎng)箱繼續(xù)處理培養(yǎng)24 h，拿出細(xì)胞，吸出上清，準(zhǔn)備泡沫盒里面放入少量液氮，將培養(yǎng)皿底部接觸液氮，并放到-20 ℃冰箱儲(chǔ)存。

取出凍好的細(xì)胞培養(yǎng)皿樣品，放置在冰上，根據(jù)細(xì)胞量加入適量的蛋白質(zhì)裂解液裂解，振蕩混勻，每5 min 振蕩一次，振蕩30 min。裂解結(jié)束后放入提前預(yù)冷好的離心機(jī)中，以4 ℃、12 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心20 min，離心完成后，吸取上清提取細(xì)胞總蛋白并定量，準(zhǔn)備新的離心管，標(biāo)記好組別，在每個(gè)管中加入0.8 mL 的無(wú)菌去離子水、200 μL 的考馬斯亮藍(lán)和1 μL 蛋白質(zhì)樣品，震蕩混勻，然后將樣品轉(zhuǎn)移到干凈的比色皿中，用分光光度計(jì)檢測(cè)595 nm 波長(zhǎng)處樣品的OD 值，根據(jù)公式計(jì)算出所測(cè)樣品的蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)檢測(cè)的蛋白濃度配置蛋白樣品，根據(jù)公式計(jì)算出所配置樣品需要的無(wú)菌去離子水體積、5×buffer 和蛋白樣品體積。每個(gè)樣品都配置好后，振蕩混勻。將其放入沸水中煮5 min，樣品煮好后拿出，插入冰中或放入4 ℃的冰箱內(nèi)冷卻。隨后進(jìn)行夾板制膠，待膠凝好后開(kāi)始點(diǎn)樣，每孔中加入15 μL 樣品，1.5 μL 的Maker，連接電泳儀，設(shè)置電泳電壓為140 V，打開(kāi)循環(huán)水開(kāi)關(guān)，開(kāi)始跑膠。電泳結(jié)束后，將PAGE 上的蛋白轉(zhuǎn)到固相載體上。連接電源在130 mA 的電流下轉(zhuǎn)膜6 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，NC 膜取出放入麗春紅溶液中進(jìn)行預(yù)染、剪膜，用TBST 緩沖液將麗春紅洗凈，然后加入5%的脫脂乳封閉1 h；封閉完成后，用TBST 洗5 遍，加入一抗孵育，4 ℃過(guò)夜孵育12 h，一抗孵育完成后，回收一抗，用TBST 洗5 遍，加入5%的脫脂乳封閉10 min，加入二抗孵育2 h。用TBST 洗5 遍，洗完后利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行照相；照相時(shí)先在NC 膜上滴加提前配置好的顯影液，并使顯影液均勻地鋪滿NC 膜，放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中成像，導(dǎo)出結(jié)果，對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

1.7 線粒體膜電位檢測(cè)

首先將3P 的Hep3B 細(xì)胞傳至兩個(gè)24 孔板中，每孔種6 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，加入1%FBS 培養(yǎng)液饑餓2 h，試驗(yàn)組加入5 μL 化合物溶液（3 μmol·L-1），放入培養(yǎng)箱繼續(xù)處理培養(yǎng)24 h，24 h后拿出細(xì)胞，吸出上清，用PBS 洗一遍，加入JC-1 染料，37 ℃避光孵育20 min。棄掉染料，加500 μL PBS后用熒光顯微鏡照相。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)表示為三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P 值小于0.05 認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組間差異采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 萘醌類衍生物的結(jié)構(gòu)鑒定

2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮：1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ 7.48（d，J=6.4 Hz，2 H），7.40（d，J=6.4 Hz，2 H），7.33（d，J1/49.6 Hz，1 H），7.27（d，J1/49.6 Hz，1 H），6.69（s，1 H），3.96（s，3 H），3.90（s，3 H），3.87（s，3 H）；13C NMR（CDCl3，150 MHz）d182.15（C-1），181.93（C-4），156.57（C’-4），154.54（C-5），154.33（C-8），153.79（C-2），153.65（C-3），133.95（C’-2），132.64（C’-6），127.24（C’-1），121.46（C-7），121.21（C-6），120.76（C-10），120.06（C-9），115.83（C’-3），115.08（C’-5），57.08（C’-4，OCH3），56.99（OCH3），56.88（OCH3）；IT-TOF/MS：m/z 378.93（m+Na）+。

為提高抗癌活性，減少1，4-萘醌的副作用，合成了2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮。以上核磁共振譜及質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)顯示，獲得的化合物屬于目標(biāo)萘醌類衍生物，并且其化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子量符合預(yù)先的合成設(shè)計(jì)，這些結(jié)果證實(shí)了新的1，4 萘醌衍生物的成功合成?；衔锝Y(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖3 2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮的結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of 2-（4-methoxy-phenylmercapto）-5，8-dimethoxynaphthalene-1，4-dione

2.2 MTT 法檢測(cè)Hep3B 細(xì)胞的細(xì)胞活力

為檢測(cè)萘醌類衍生物對(duì)Hep3B 細(xì)胞的毒性，以0.3、1、3、10 μmol·L-1濃度的萘醌類化合物處理Hep3B 細(xì)胞24 h，通過(guò)MTT 方法對(duì)Hep3B 細(xì)胞的細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)（圖4）。結(jié)果顯示，2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮處理Hep3B 細(xì)胞后，Hep3B 細(xì)胞活力明顯下降，并且抑制作用呈濃度依賴性。

圖4 萘醌類衍生物對(duì)Hep3B 細(xì)胞活力的影響Fig.4 Effect of naphthoquinone derivatives on Hep3B cell viability

2.3 2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮誘導(dǎo)Hep3B 細(xì)胞凋亡

為探究2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮如何導(dǎo)致Hep3B 細(xì)胞活力下降，試驗(yàn)采用蛋白免疫印跡分析方法對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測(cè)，用濃度為10 μmol·L-1的2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮處理24 h，檢測(cè)Hep3B細(xì)胞凋亡信號(hào)關(guān)鍵蛋白。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮處理組的凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase3 表達(dá)水平明顯升高，且促凋亡蛋白Bad、Bax 表達(dá)水平也顯著增加（圖5），說(shuō)明2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮能誘導(dǎo)Hep3B 細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖5 2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮誘導(dǎo)Hep3B 細(xì)胞凋亡Fig.5 Apoptosis of Hep3B cells induced by 2-（4-methoxy-phenylmercapto）-5，8-dimethoxynaphthalene-1，4-dione

2.4 2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮通過(guò)線粒體損傷誘導(dǎo)Hep3B 細(xì)胞凋亡

研究表明，線粒體損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。當(dāng)線粒體發(fā)生損傷時(shí)，線粒體膜電位下降。為進(jìn)一步檢測(cè)2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮誘導(dǎo)Hep3B 細(xì)胞發(fā)生凋亡的原因，使用熒光探針JC-1 檢測(cè)2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮處理后Hep3B 細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化。JC-1 是一種熒光探針，它可以在正常的線粒體基質(zhì)中形成多聚體進(jìn)行積累，產(chǎn)生明顯的紅色熒光，當(dāng)膜電位下降時(shí)，JC-1 從線粒體中釋放出來(lái)，以單體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，產(chǎn)生綠色熒光。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮處理組紅色熒光明顯減弱，綠色熒光明顯增強(qiáng)（圖6），說(shuō)明2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮能通過(guò)線粒體損傷誘導(dǎo)Hep3B 細(xì)胞凋亡。

圖6 線粒體膜電位檢測(cè)Fig.6 Mitochondrial membrane potential detection

3 討論

1，4-萘醌一直是一個(gè)熱門話題，因?yàn)槠溲苌锞哂袕V泛的生物效益，包括抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗病毒和抗癌特性。然而，副作用和高毒性限制了其臨床應(yīng)用[14]。萘醌衍生物由于其誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和調(diào)節(jié)凋亡途徑相關(guān)蛋白的能力，而被評(píng)估為癌癥藥物候選。研究發(fā)現(xiàn)，不同的萘醌取代基具有不同的細(xì)胞毒性活性，這似乎是由于其結(jié)構(gòu)中的羥基[15]。一些研究表明，細(xì)胞凋亡在多種腫瘤細(xì)胞中受到抑制，導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)和對(duì)細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物的耐藥性。因此，闡明細(xì)胞凋亡機(jī)制對(duì)于預(yù)防和治療包括癌癥在內(nèi)的各種疾病非常重要[16]。C5 和C8 上的2，5-二羥基取代已被證明可以改善萘醌衍生物的抗癌效果，但也會(huì)導(dǎo)致更多的副作用和毒性。因此，合成了一種高效低毒的萘醌類衍生物2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮。MTT 法顯示2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮抑制人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，MTT 分析結(jié)果促使進(jìn)一步研究細(xì)胞凋亡，以確定2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮的機(jī)制。

細(xì)胞凋亡，也稱為I 型程序性細(xì)胞死亡，是最常見(jiàn)的靶向化療利用的共同機(jī)制，可誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡[17]。在針對(duì)多種癌癥的化療中，細(xì)胞凋亡有助于消除不健康或受損的細(xì)胞，并維持體內(nèi)平衡，1，4-萘醌衍生物可以激活細(xì)胞凋亡，在癌癥治療中有很大的潛力。闡明細(xì)胞凋亡的機(jī)制對(duì)于預(yù)防和治療包括癌癥在內(nèi)的各種疾病非常重要。細(xì)胞凋亡中的線粒體信號(hào)通路Bcl-2 家族和Caspase 家族蛋白，已被證明是通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡來(lái)決定肝癌細(xì)胞命運(yùn)的生物標(biāo)志物[18]。Bcl-2 家族的抗凋亡成員是線粒體凋亡途徑的監(jiān)護(hù)人，Bax 和Bad 作為促凋亡蛋白發(fā)揮功能。紫草素可以使黑色素瘤細(xì)胞A375－S2 的P53 蛋白表達(dá)量增加，增加的P53 蛋白激活促凋亡蛋白質(zhì)Bax，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞線粒體大量釋放細(xì)胞色素c 激活Caspase 家族蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生線粒體依賴的細(xì)胞凋亡。Caspase-3 是凋亡過(guò)程中最重要的末端剪切酶，也是細(xì)胞死亡機(jī)制的重要組成部分。最近的研究表明，萘醌衍生物DMNQ S-64 通過(guò)降低A549 細(xì)胞中Bcl-2 的蛋白表達(dá)和激活Caspase 途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。同樣，研究結(jié)果表明，2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮通過(guò)增加促凋亡蛋白Bad、Bax 和切割的Caspase-3 的水平誘導(dǎo)凋亡?？傊?，這些結(jié)果表明，2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮對(duì)人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用與誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的凋亡有關(guān)。

線粒體是高度調(diào)控的細(xì)胞器，負(fù)責(zé)能量生產(chǎn)和氧化還原穩(wěn)態(tài)，是細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)力車間[20]。在正常細(xì)胞中，當(dāng)膜電位正常時(shí)，JC-1 會(huì)進(jìn)入線粒體內(nèi)，由于濃度升高而形成發(fā)射紅色熒光的多聚體[21]；在凋亡細(xì)胞中，線粒體跨膜電位會(huì)發(fā)生去極化，JC-1 會(huì)從線粒體內(nèi)釋放，導(dǎo)致濃度降低，轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)射綠色熒光的單體形式[22]。因此，可以通過(guò)綠色和紅色熒光檢測(cè)線粒體膜電位的變化。試驗(yàn)通過(guò)JC-1 檢測(cè)線粒體膜電位，用2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮處理Hep3B 細(xì)胞24 h，通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)熒光情況[23]。結(jié)果顯示，藥物處理組的綠色熒光高于對(duì)照組，相反紅色熒光低于對(duì)照組，說(shuō)明2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮通過(guò)細(xì)胞Hep3B線粒體發(fā)生損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。總之，該化合物能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，2-（4-甲氧基-苯巰基）-5，8-二甲氧基萘-1，4-二酮可能是肝癌治療的有吸引力的候選藥物。

4 結(jié)論

紫草萘醌類衍生物是一種良好的抗癌藥物，研究表明紫草萘醌類衍生物可以抑制Hep3B 肝癌細(xì)胞活力，通過(guò)上調(diào)Bad 和Cleaved-caspase-3、Bax 促凋亡蛋白表達(dá)水平，并且通過(guò)線粒體損傷來(lái)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。總之，紫草萘醌類衍生物對(duì)肝癌治療提供了試驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。