劉曉冬,韓英浩
(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,大慶 163319)
肝癌是我國(guó)高發(fā)的、危害極大的惡性腫瘤,其死亡率居全球癌癥死亡率第4 位[1]。肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma HCC)是最常見(jiàn)的肝癌類型,約占總病例數(shù)的90%,給我國(guó)醫(yī)療帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[2]。在中國(guó),原發(fā)性肝臟腫瘤的發(fā)病率特別高,約占全球新增病例和死亡病例的50%。據(jù)報(bào)道,肝癌男性死亡率為37.5/100 000,女性死亡率為14.4/100 000,對(duì)人類健康和生命構(gòu)成嚴(yán)重威脅[3]。目前,肝癌的有效治療方法包括手術(shù)治療、化療和放療。然而,這些療法可能會(huì)導(dǎo)致一些副作用,如腎損傷和聽(tīng)力障礙[4]。腫瘤的基因治療發(fā)展較快,理論和技術(shù)正在成熟過(guò)程中,逐漸被患者接受,但價(jià)格昂貴,化療是化學(xué)治療的簡(jiǎn)稱,化療在腫瘤治療中的應(yīng)用最廣泛,需要提高治療效果,有效地控制擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移,主要因其毒副作用,限制了臨床的使用。因此,迫切需要合成更加安全有效的新化合物,以減少HCC 在治療期間的細(xì)胞毒性。因此,設(shè)計(jì)合成高效低毒的化學(xué)治療藥物有很大的意義。
細(xì)胞凋亡是化學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的一種活性形式,其特征在于有序的細(xì)胞死亡,并由線粒體功能障礙介導(dǎo)。在癌癥治療中,細(xì)胞凋亡作為最佳的治療方法。通常來(lái)說(shuō),有兩種蛋白參與了細(xì)胞凋亡過(guò)程,促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白,Bax 蛋白是活性非常強(qiáng)的一種促凋亡蛋白。如果能在癌細(xì)胞中顯著激活這一蛋白,可實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞凋亡的控制[5]。Bcl-2 是與細(xì)胞凋亡相關(guān)的癌基因,可以通過(guò)線粒體途徑參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控,在許多人類腫瘤細(xì)胞中都存在過(guò)表達(dá)或異常表達(dá)的現(xiàn)象[6]。Caspase-3 也是細(xì)胞死亡機(jī)制的重要組成部分[7]。此外,細(xì)胞凋亡是從體內(nèi)去除衰老細(xì)胞的常用方法,在生物體發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。大多數(shù)抗癌療法觸發(fā)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo),并調(diào)節(jié)信號(hào)通路以消除癌細(xì)胞。線粒體在誘導(dǎo)細(xì)胞死亡信號(hào)的整合和傳遞中起重要作用。因此,抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡是很好的治療手段。
線粒體膜電位(Δμm)是線粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子分布不均所形成的電化學(xué)梯度[8]。當(dāng)細(xì)胞因線粒體損傷而誘導(dǎo)凋亡時(shí),其膜電位已經(jīng)開(kāi)始改變,膜通透性增加,跨膜電位下降[9]。用熒光探針JC1 測(cè)定Hep3B 細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位變化,正常情況下細(xì)胞的線粒體膜電位相對(duì)較高,JC1 探針可以在線粒體基質(zhì)中進(jìn)行積累,累積后會(huì)形成化學(xué)聚合物,可以產(chǎn)生明顯的紅色熒光[10]。研究表明,線粒體損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡,線粒體膜電位為細(xì)胞的健康和功能狀態(tài)提供了有價(jià)值的指標(biāo)。當(dāng)線粒體發(fā)生損傷時(shí),線粒體膜電位下降[11]。
1,4-萘醌化合物因其潛在的生物學(xué)益處,包括抗炎和抗菌活性而被廣泛研究。此外,1,4-萘醌藥效團(tuán)表現(xiàn)出抗癌活性,并且是先前研究的焦點(diǎn)[12]。在1,4-萘醌化合物中,好多已被用于開(kāi)發(fā)有效的抗癌藥物。然而,這些化合物表現(xiàn)出高水平的細(xì)胞毒性和顯著的副作用,使得它們?cè)谂R床環(huán)境中作為抗癌藥物的應(yīng)用存在問(wèn)題[13]。為了開(kāi)發(fā)具有降低副作用和優(yōu)化抗腫瘤作用的化合物,研究設(shè)計(jì)合成了一種新的1,4-萘醌衍生物2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮,并對(duì)抗腫瘤活性進(jìn)行評(píng)價(jià),研究在人肝細(xì)胞癌(HCC)細(xì)胞Hep3B 中的細(xì)胞毒性作用、凋亡作用、線粒體損傷的潛在機(jī)制,為抗癌藥物的合成設(shè)計(jì)提供前期研究基礎(chǔ)。
人肝癌細(xì)胞系Hep3B,來(lái)自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院干細(xì)胞與再生生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。
1,5-二羥基萘(AR 華藍(lán)試劑),硫酸二甲酯(AR Sigma-Aldrich),N-溴代丁二酰亞胺(AR Sigma-Aldrich),甲醇鈉(AR 阿拉丁),碘化鉀(AR 華藍(lán)試劑),硝酸鈰銨(AR Sigma-Aldrich),以上各種試劑均為分析純;青霉素鏈霉素混合液(P/S)購(gòu)自北京索萊寶公司;DNEM/高糖培養(yǎng)液購(gòu)自北京索萊寶公司;胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州四季青公司;含EDTA 的胰蛋白酶(T/E)購(gòu)自北京索萊寶公司;細(xì)胞緩沖液(PBS)購(gòu)自美國(guó)Hyclon 公司;噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Amresco 公司;Acrylamide、Bis-acrylamide、Tris-base(堿)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)、吐溫-20(Tween-20)、1 M Tris-HCl(pH=6.8)、1.5 M Tris-HCl(pH=8.8)、麗春紅、考馬斯亮藍(lán)等蛋白免疫印記系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司;電泳槽購(gòu)自瑞典Bio-Sciences AB 公司;Western blot 轉(zhuǎn)膜桶購(gòu)自瑞典Bio-Sciences AB 公司;熒光化學(xué)成像系統(tǒng)購(gòu)自GE 公司;全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio Tek 公司。
1.3.1 中間體5,8-二甲氧基-1,4-萘醌的合成
為合成DMNQ 的衍生物,試驗(yàn)以1,5-二羥基萘為原料,在25 ℃弱堿性溶液的條件下,與硫酸二甲酯進(jìn)行反應(yīng),使羥基甲基化得到1,5-二甲氧基萘。利用N-溴代丁二酰亞胺(NBS)的自由基反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行一系列的溴化反應(yīng),并且降低了溴化反應(yīng)試劑的毒性,最終得到4,8-二溴-1,5-二甲氧基萘。在甲醇鈉和碘化鉀的催化反應(yīng)下,并以甲醇和二甲基甲酰胺混合物為溶劑加熱回流約30 h,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮,再用乙酸乙酯重結(jié)晶得1,4,5,8-四甲氧基萘,將硝酸鈰銨溶解于水中,并將其添加到含有1,4,5,8-四甲氧基萘的氯仿和乙腈的混合溶液中,并在室溫下攪拌1 h。所得有機(jī)層加入氯仿和飽和鹽水萃取,使其分離,再加入無(wú)水硫酸鈉除去其中的水分,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至殘?jiān)?。所得殘?jiān)尤爰状肌⒓訜崂鋮s,使其重結(jié)晶,生成中間體5,8-二甲氧基-1,4-萘醌(DMNQ)。
圖1 5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮(DMNQ)的合成Fig.1 Synthesis of 5,8-dimethoxynaphthalene-1,4-dione(DMNQ)
1.3.2 2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮的合成
以DMNQ 為底物,利用典型的邁克爾加成反應(yīng)得到DMNQ 衍生物2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮。
圖2 2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮的合成Fig.2 Synthesis of 2-(4-methoxy-phenylmercapto)-5,8-dimethoxynaphthalene-1,4-dione
將Hep3B 細(xì)胞復(fù)蘇到6 cm 培養(yǎng)皿里,Hep3B 細(xì)胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基(DMEM)中,含有10%滅活的新生胎牛血清(FBS)和1%的抗生素(青霉素/鏈霉素),并置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng),24 h 換液,48 h 傳代。
將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep3B 細(xì)胞接種在96 孔板中,傳代時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),每個(gè)孔接種5 000 個(gè)細(xì)胞,并放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,取出96 孔板,將上清液棄掉,加入含有1% FBS 的饑餓培養(yǎng)液處理2 h,棄去饑餓的培養(yǎng)液,在試驗(yàn)組分別加入1 μL 化合物溶液(化合物的終末濃度分別為0.3,1,3,10 μmol·L-1),對(duì)照組加入1 μL DMSO 對(duì)照液。藥物處理采用5 個(gè)濃度梯度,4 個(gè)復(fù)孔,溶劑對(duì)照也為4 個(gè)復(fù)孔?;衔锾幚砼囵B(yǎng)24 h 后,取出96 孔板,在每個(gè)孔中加入10 μL 的MTT 染液,放入培養(yǎng)箱繼續(xù)處理培養(yǎng)2 h,棄去上清,每孔加入100 μL 二甲基亞砜溶液,放入培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)10 min 后,拿出并包上錫紙避光。用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD 值,檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm,導(dǎo)出數(shù)據(jù),根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率,并計(jì)算半數(shù)致死濃度。
將細(xì)胞接種于2 個(gè)6 cm 培養(yǎng)皿中,每個(gè)培養(yǎng)皿接種8 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后,試驗(yàn)組加入50 μL 化合物溶液(3 μmol·L-1),放入培養(yǎng)箱繼續(xù)處理培養(yǎng)24 h,拿出細(xì)胞,吸出上清,準(zhǔn)備泡沫盒里面放入少量液氮,將培養(yǎng)皿底部接觸液氮,并放到-20 ℃冰箱儲(chǔ)存。
取出凍好的細(xì)胞培養(yǎng)皿樣品,放置在冰上,根據(jù)細(xì)胞量加入適量的蛋白質(zhì)裂解液裂解,振蕩混勻,每5 min 振蕩一次,振蕩30 min。裂解結(jié)束后放入提前預(yù)冷好的離心機(jī)中,以4 ℃、12 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心20 min,離心完成后,吸取上清提取細(xì)胞總蛋白并定量,準(zhǔn)備新的離心管,標(biāo)記好組別,在每個(gè)管中加入0.8 mL 的無(wú)菌去離子水、200 μL 的考馬斯亮藍(lán)和1 μL 蛋白質(zhì)樣品,震蕩混勻,然后將樣品轉(zhuǎn)移到干凈的比色皿中,用分光光度計(jì)檢測(cè)595 nm 波長(zhǎng)處樣品的OD 值,根據(jù)公式計(jì)算出所測(cè)樣品的蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)檢測(cè)的蛋白濃度配置蛋白樣品,根據(jù)公式計(jì)算出所配置樣品需要的無(wú)菌去離子水體積、5×buffer 和蛋白樣品體積。每個(gè)樣品都配置好后,振蕩混勻。將其放入沸水中煮5 min,樣品煮好后拿出,插入冰中或放入4 ℃的冰箱內(nèi)冷卻。隨后進(jìn)行夾板制膠,待膠凝好后開(kāi)始點(diǎn)樣,每孔中加入15 μL 樣品,1.5 μL 的Maker,連接電泳儀,設(shè)置電泳電壓為140 V,打開(kāi)循環(huán)水開(kāi)關(guān),開(kāi)始跑膠。電泳結(jié)束后,將PAGE 上的蛋白轉(zhuǎn)到固相載體上。連接電源在130 mA 的電流下轉(zhuǎn)膜6 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,NC 膜取出放入麗春紅溶液中進(jìn)行預(yù)染、剪膜,用TBST 緩沖液將麗春紅洗凈,然后加入5%的脫脂乳封閉1 h;封閉完成后,用TBST 洗5 遍,加入一抗孵育,4 ℃過(guò)夜孵育12 h,一抗孵育完成后,回收一抗,用TBST 洗5 遍,加入5%的脫脂乳封閉10 min,加入二抗孵育2 h。用TBST 洗5 遍,洗完后利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行照相;照相時(shí)先在NC 膜上滴加提前配置好的顯影液,并使顯影液均勻地鋪滿NC 膜,放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中成像,導(dǎo)出結(jié)果,對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析。
首先將3P 的Hep3B 細(xì)胞傳至兩個(gè)24 孔板中,每孔種6 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后,加入1%FBS 培養(yǎng)液饑餓2 h,試驗(yàn)組加入5 μL 化合物溶液(3 μmol·L-1),放入培養(yǎng)箱繼續(xù)處理培養(yǎng)24 h,24 h后拿出細(xì)胞,吸出上清,用PBS 洗一遍,加入JC-1 染料,37 ℃避光孵育20 min。棄掉染料,加500 μL PBS后用熒光顯微鏡照相。
采用SPSS20.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)表示為三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,P 值小于0.05 認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,組間差異采用單因素方差分析。
2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮:1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 7.48(d,J=6.4 Hz,2 H),7.40(d,J=6.4 Hz,2 H),7.33(d,J1/49.6 Hz,1 H),7.27(d,J1/49.6 Hz,1 H),6.69(s,1 H),3.96(s,3 H),3.90(s,3 H),3.87(s,3 H);13C NMR(CDCl3,150 MHz)d182.15(C-1),181.93(C-4),156.57(C’-4),154.54(C-5),154.33(C-8),153.79(C-2),153.65(C-3),133.95(C’-2),132.64(C’-6),127.24(C’-1),121.46(C-7),121.21(C-6),120.76(C-10),120.06(C-9),115.83(C’-3),115.08(C’-5),57.08(C’-4,OCH3),56.99(OCH3),56.88(OCH3);IT-TOF/MS:m/z 378.93(m+Na)+。
為提高抗癌活性,減少1,4-萘醌的副作用,合成了2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮。以上核磁共振譜及質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)顯示,獲得的化合物屬于目標(biāo)萘醌類衍生物,并且其化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子量符合預(yù)先的合成設(shè)計(jì),這些結(jié)果證實(shí)了新的1,4 萘醌衍生物的成功合成?;衔锝Y(jié)構(gòu)如圖3所示。
圖3 2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮的結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of 2-(4-methoxy-phenylmercapto)-5,8-dimethoxynaphthalene-1,4-dione
為檢測(cè)萘醌類衍生物對(duì)Hep3B 細(xì)胞的毒性,以0.3、1、3、10 μmol·L-1濃度的萘醌類化合物處理Hep3B 細(xì)胞24 h,通過(guò)MTT 方法對(duì)Hep3B 細(xì)胞的細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)(圖4)。結(jié)果顯示,2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮處理Hep3B 細(xì)胞后,Hep3B 細(xì)胞活力明顯下降,并且抑制作用呈濃度依賴性。
圖4 萘醌類衍生物對(duì)Hep3B 細(xì)胞活力的影響Fig.4 Effect of naphthoquinone derivatives on Hep3B cell viability
為探究2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮如何導(dǎo)致Hep3B 細(xì)胞活力下降,試驗(yàn)采用蛋白免疫印跡分析方法對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測(cè),用濃度為10 μmol·L-1的2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮處理24 h,檢測(cè)Hep3B細(xì)胞凋亡信號(hào)關(guān)鍵蛋白。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮處理組的凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase3 表達(dá)水平明顯升高,且促凋亡蛋白Bad、Bax 表達(dá)水平也顯著增加(圖5),說(shuō)明2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮能誘導(dǎo)Hep3B 細(xì)胞發(fā)生凋亡。
圖5 2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮誘導(dǎo)Hep3B 細(xì)胞凋亡Fig.5 Apoptosis of Hep3B cells induced by 2-(4-methoxy-phenylmercapto)-5,8-dimethoxynaphthalene-1,4-dione
研究表明,線粒體損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。當(dāng)線粒體發(fā)生損傷時(shí),線粒體膜電位下降。為進(jìn)一步檢測(cè)2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮誘導(dǎo)Hep3B 細(xì)胞發(fā)生凋亡的原因,使用熒光探針JC-1 檢測(cè)2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮處理后Hep3B 細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的變化。JC-1 是一種熒光探針,它可以在正常的線粒體基質(zhì)中形成多聚體進(jìn)行積累,產(chǎn)生明顯的紅色熒光,當(dāng)膜電位下降時(shí),JC-1 從線粒體中釋放出來(lái),以單體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中,產(chǎn)生綠色熒光。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮處理組紅色熒光明顯減弱,綠色熒光明顯增強(qiáng)(圖6),說(shuō)明2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮能通過(guò)線粒體損傷誘導(dǎo)Hep3B 細(xì)胞凋亡。
圖6 線粒體膜電位檢測(cè)Fig.6 Mitochondrial membrane potential detection
1,4-萘醌一直是一個(gè)熱門話題,因?yàn)槠溲苌锞哂袕V泛的生物效益,包括抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗病毒和抗癌特性。然而,副作用和高毒性限制了其臨床應(yīng)用[14]。萘醌衍生物由于其誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和調(diào)節(jié)凋亡途徑相關(guān)蛋白的能力,而被評(píng)估為癌癥藥物候選。研究發(fā)現(xiàn),不同的萘醌取代基具有不同的細(xì)胞毒性活性,這似乎是由于其結(jié)構(gòu)中的羥基[15]。一些研究表明,細(xì)胞凋亡在多種腫瘤細(xì)胞中受到抑制,導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)和對(duì)細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物的耐藥性。因此,闡明細(xì)胞凋亡機(jī)制對(duì)于預(yù)防和治療包括癌癥在內(nèi)的各種疾病非常重要[16]。C5 和C8 上的2,5-二羥基取代已被證明可以改善萘醌衍生物的抗癌效果,但也會(huì)導(dǎo)致更多的副作用和毒性。因此,合成了一種高效低毒的萘醌類衍生物2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮。MTT 法顯示2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮抑制人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng),MTT 分析結(jié)果促使進(jìn)一步研究細(xì)胞凋亡,以確定2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮的機(jī)制。
細(xì)胞凋亡,也稱為I 型程序性細(xì)胞死亡,是最常見(jiàn)的靶向化療利用的共同機(jī)制,可誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡[17]。在針對(duì)多種癌癥的化療中,細(xì)胞凋亡有助于消除不健康或受損的細(xì)胞,并維持體內(nèi)平衡,1,4-萘醌衍生物可以激活細(xì)胞凋亡,在癌癥治療中有很大的潛力。闡明細(xì)胞凋亡的機(jī)制對(duì)于預(yù)防和治療包括癌癥在內(nèi)的各種疾病非常重要。細(xì)胞凋亡中的線粒體信號(hào)通路Bcl-2 家族和Caspase 家族蛋白,已被證明是通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡來(lái)決定肝癌細(xì)胞命運(yùn)的生物標(biāo)志物[18]。Bcl-2 家族的抗凋亡成員是線粒體凋亡途徑的監(jiān)護(hù)人,Bax 和Bad 作為促凋亡蛋白發(fā)揮功能。紫草素可以使黑色素瘤細(xì)胞A375-S2 的P53 蛋白表達(dá)量增加,增加的P53 蛋白激活促凋亡蛋白質(zhì)Bax,進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞線粒體大量釋放細(xì)胞色素c 激活Caspase 家族蛋白,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生線粒體依賴的細(xì)胞凋亡。Caspase-3 是凋亡過(guò)程中最重要的末端剪切酶,也是細(xì)胞死亡機(jī)制的重要組成部分。最近的研究表明,萘醌衍生物DMNQ S-64 通過(guò)降低A549 細(xì)胞中Bcl-2 的蛋白表達(dá)和激活Caspase 途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。同樣,研究結(jié)果表明,2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮通過(guò)增加促凋亡蛋白Bad、Bax 和切割的Caspase-3 的水平誘導(dǎo)凋亡??傊?,這些結(jié)果表明,2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮對(duì)人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用與誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的凋亡有關(guān)。
線粒體是高度調(diào)控的細(xì)胞器,負(fù)責(zé)能量生產(chǎn)和氧化還原穩(wěn)態(tài),是細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)力車間[20]。在正常細(xì)胞中,當(dāng)膜電位正常時(shí),JC-1 會(huì)進(jìn)入線粒體內(nèi),由于濃度升高而形成發(fā)射紅色熒光的多聚體[21];在凋亡細(xì)胞中,線粒體跨膜電位會(huì)發(fā)生去極化,JC-1 會(huì)從線粒體內(nèi)釋放,導(dǎo)致濃度降低,轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)射綠色熒光的單體形式[22]。因此,可以通過(guò)綠色和紅色熒光檢測(cè)線粒體膜電位的變化。試驗(yàn)通過(guò)JC-1 檢測(cè)線粒體膜電位,用2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮處理Hep3B 細(xì)胞24 h,通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)熒光情況[23]。結(jié)果顯示,藥物處理組的綠色熒光高于對(duì)照組,相反紅色熒光低于對(duì)照組,說(shuō)明2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮通過(guò)細(xì)胞Hep3B線粒體發(fā)生損傷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。總之,該化合物能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡,2-(4-甲氧基-苯巰基)-5,8-二甲氧基萘-1,4-二酮可能是肝癌治療的有吸引力的候選藥物。
紫草萘醌類衍生物是一種良好的抗癌藥物,研究表明紫草萘醌類衍生物可以抑制Hep3B 肝癌細(xì)胞活力,通過(guò)上調(diào)Bad 和Cleaved-caspase-3、Bax 促凋亡蛋白表達(dá)水平,并且通過(guò)線粒體損傷來(lái)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。總之,紫草萘醌類衍生物對(duì)肝癌治療提供了試驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。
黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)2024年1期