李欣 李魯華 任明見 安暢 洪鼎立 趙鵬鵬 徐如宏

摘要：為了探討線粒體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)蛋白TaMICU1基因在小麥生長發(fā)育中的功能，以小麥中國春為材料，對其TaMICU1-6A基因進行克隆、生物信息學分析、表達分析研究，結(jié)果表明，小麥TaMICU1-6A基因全長為1 398 bp，編碼465個氨基酸，定位于線粒體，具有2個EF-hand家族的保守結(jié)構(gòu)域，啟動子含3種激素響應元件、3種光響應相關(guān)反應元件、1個缺氧特異性誘導相關(guān)元件；多重序列比對發(fā)現(xiàn)，其與野生二粒小麥、烏拉爾圖小麥、小麥中的同源蛋白或同源基因的親緣關(guān)系比較近。RT-PCR結(jié)果表明，TaMICU1-6A基因具有組織特異性，不同非生物脅迫、不同激素處理下在根、莖、葉中的表達水平不同。黑暗處理下，TaMICU1-6A基因在根、莖、葉中的表達水平均在6 h時達到最低；低溫處理下，TaMICU1-6A基因在根、莖中的表達水平呈先降后升的趨勢；在赤霉素處理下，TaMICU1-6A基因在葉片中的表達水平在6 h時達到最高。綜上所述，推測TaMICU1-6A基因通過激素介導的信號途徑參與不同的非生物脅迫。期待本研究結(jié)果可為進一步探討小麥TaMICU1基因在逆境下的生物學功能提供一定的參考價值。

關(guān)鍵詞：小麥；TaMICU1基因；基因克?。簧镄畔W分析；基因表達

中圖分類號：Q78；S512.101? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）05-0042-09

在細胞的信號傳導過程中，鈣離子（Ca2+）作為重要的信使而存在［1-3］。很多生理過程都會因存在于細胞間的Ca2+濃度的升降產(chǎn)生相應的變化，如生物、非生物脅迫，生長發(fā)育的調(diào)控以及氣孔動力學等［4-12］。線粒體是細胞內(nèi)重要的細胞器且其具有Ca2+緩沖能力，線粒體Ca2+穩(wěn)態(tài)在細胞生理學中起著重要作用［13-15］。通過線粒體內(nèi)膜（inner mitochondrial membrane，IMM）的Ca2+通量可以調(diào)節(jié)細胞生物能量學、細胞質(zhì)Ca2+信號以及細胞凋亡途徑的激活［16-19］。Ca2+流入線粒體可作為調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣信號轉(zhuǎn)導的鈣庫，而線粒體Ca2+攝取的主要途徑是通過線粒體外膜中的電壓依賴性陰離子選擇性通道和內(nèi)膜中的線粒體鈣單轉(zhuǎn)運蛋白復合物［19-21］。這種復合物包括成孔亞基線粒體鈣單轉(zhuǎn)運蛋白MCU，其與Ca2+感應調(diào)節(jié)器線粒體鈣攝取MICU1（mitochondrial calcium uptake 1）或其同系物MICU2［22］一起調(diào)節(jié)Ca2+的攝?。?3-28］。MICU1和MCU在生物化學上相互作用，它們的表達模式在組織和物種之間緊密耦合，有研究證明，植物MCU在線粒體Ca2+適應非生物脅迫過程中發(fā)揮作用，但MICU1在植物適應生物脅迫與非生物脅迫過程中的作用尚不清楚［22，29］。

MICU1是一種具有2個EF-hand結(jié)構(gòu)域的膜蛋白［25］。EF-hand結(jié)構(gòu)域是MICU1感知和調(diào)節(jié)鈣信號傳導能力的關(guān)鍵部分，MICU1基于細胞質(zhì)中的Ca2+濃度來調(diào)節(jié)Ca2+的攝取，在低濃度時關(guān)閉MCU，在高濃度時打開MCU，從而使其能夠控制細胞功能，例如信號傳導、能量代謝、細胞死亡、組織再生等［22-23，26-27］。MICU1在進化上是多樣的，存在于一些原生動物、原生生物、植物、后生動物中［30］。在人體內(nèi)MICU1基因的功能缺失突變，會導致與線粒體鈣信號相關(guān)的大腦和肌肉疾病，表現(xiàn)為患有近端肌病、產(chǎn)生學習困難及進行性錐體外系運動障礙等不同情況［31］。另有研究表明，MICU1基因突變與兒童神經(jīng)肌肉疾病之間存在遺傳聯(lián)系，該基因中的純合缺失還與兒童疲勞和嗜睡有關(guān)［32］。

前人對植物進行了精細的系統(tǒng)發(fā)育分析，確認MICU在整個植物界都是保守的，這表明MICU1基因在植物中有著重要作用［33］。目前，MICU基因在植物生長發(fā)育過程中的作用僅在擬南芥上得到明確。Wagner等發(fā)現(xiàn)，擬南芥MICU（AtMICU；AT4G32060）的氨基酸序列與人類同源物顯示出45%的相似性和25%的同一性，且預測AtMICU蛋白中具有3個EF-hand結(jié)構(gòu)域［21］。脊椎動物中存在的MICU1亞型MICU2、MICU3的同系物，在擬南芥中并不存在［28］。Wang等檢測了MICU在擬南芥不同部位的表達水平，結(jié)果顯示MICU在花中表達量最高，而在根、莖、葉中表達量相似［34］。在缺乏MICU基因表達的擬南芥根中對游離Ca2+濃度進行活體成像顯示，穩(wěn)態(tài)條件下Ca2+在線粒體基質(zhì)中積累，線粒體中Ca2+瞬時變化，而細胞質(zhì)中Ca2+濃度不受影響，因此得出結(jié)論，AtMICU基因顯示出與哺乳動物MICU2基因相似的功能，負責調(diào)控Ca2+的攝?。?1］。除了在擬南芥上的研究，對MICU1基因在植物生長發(fā)育過程中的研究較少，特別是關(guān)于小麥中TaMICU1基因的研究還未見報道。本研究利用小麥品種中國春克隆TaMICU1基因，并對該基因進行生物信息學和基因表達分析，初步推測其基因功能，旨在為進一步研究TaMICU1基因參與調(diào)控小麥生物學過程的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和脅迫處理

本研究以中國春小麥為試驗材料，種植于貴州大學農(nóng)學院國家小麥改良中心組培室，生長至2周時進行根、莖、葉不同組織的取樣及總RNA提取。試驗時間為2023年3月2日至2023年4月14日，試驗地點為貴州大學農(nóng)學院。

1.2 植物材料的處理

以2周苗齡的中國春小麥為材料，進行生長素（100 μmol/L）、赤霉素（100 μmol/L）、黑暗、低溫（4 ℃）、鹽處理（200 mmol/L）等非生物脅迫處理［35-37］，每個脅迫處理重復5次，分別于0、3、6、12、24 h取不同組織（根、莖、葉）進行qPCR 檢測。所收集的樣品儲存于適宜條件，并進行后續(xù)試驗。

1.3 植物總RNA的提取和cDNA的合成

根據(jù)植物總RNA提取試劑盒的操作說明，進行植物總RNA的提?。厶旄萍迹ū本┯邢薰荆?。利用FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預混試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］進行反轉(zhuǎn)錄，獲得中國春根、莖、葉的cDNA。

1.4 TaMICU1-6A基因克隆

從Ensemble Plant中獲得小麥TaMICU1-6A基因序列，設計引物（表1）。以上述cDNA為模板進行目的基因的擴增。擴增產(chǎn)物的測序試驗由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.5 TaMICU1-6A基因生物信息學分析

利用在線工具及軟件（表2）對小麥TaMICU1-6A基因進行生物信息學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaMICU1-6A基因的克隆

以中國春的cDNA作為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析（圖1）。測序結(jié)果與預測一致，為1 398 bp。

2.2 TaMICU1-6A編碼蛋白理化性質(zhì)分析

利用在線工具 Expasy-ProtParam 預測，結(jié)果（表3）顯示：該蛋白一共編碼465個氨基酸，其中丙氨酸（Alanine，Ala）占氨基酸總數(shù)的10.3%，色氨酸（Tryptophan）含量最低，為2個，占氨基酸總數(shù)的0.4%。其分子式為C2 333H3 627N651O683S18，預測分子量為52 300.50，理論等電點（pI）為5.84，總原子數(shù)為7 312，不穩(wěn)定指數(shù)為-0.253，脂肪指數(shù)為80.41，是穩(wěn)定蛋白。

2.3 TaMICU1-6A編碼蛋白功能結(jié)構(gòu)域、信號肽與親疏水性分析

通過NCBI的CD search預測結(jié)果（圖2）顯示，TaMICU1-6A蛋白具有2個EF-hand家族的保守結(jié)構(gòu)域。

使用SingalP 4.1 Server預測，結(jié)果顯示TaMICU1-6A蛋白有信號肽（圖3），且其D值為0.611，由此可推測TaMICU1-6A基因編碼的蛋白屬于分泌蛋白。

使用ProtScale在線軟件對其進行預測，結(jié)果（圖4）顯示，TaMICU1-6A編碼的蛋白為疏水蛋白。

2.4 TaMICU1-6A編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點預測

使用TMHMM在線軟件預測，結(jié)果（圖5）顯示，此蛋白質(zhì)無明顯的跨膜區(qū)域。

使用在線軟件NetPhos 3.1 Server預測磷酸化位點，結(jié)果（圖6）顯示，TaMICU1-6A蛋白有32個磷酸化位點，其中絲氨酸（Serine）、蘇氨酸（Threonine）、酪氨酸（Tyrosine）的數(shù)量分別為20、10、2個。最有可能是潛在的磷酸化位點有6個，其值均高于0.950。

2.5 TaMICU1-6A編碼蛋白亞細胞定位預測

利用Cell-PLoc 2.0對TaMICU1-6A基因進行預測，結(jié)果顯示其定位在細胞膜上。同時通過WoLF PSORT對TaMICU1-6A蛋白進行預測，預測結(jié)果（表4）顯示該蛋白屬于內(nèi)在膜蛋白，定位在線粒體上。

2.6 TaMICU1-6A編碼蛋白二、三級結(jié)構(gòu)預測分析

利用SOPMA、SWISS-MODEL在線網(wǎng)站對其進行二級、三級結(jié)構(gòu)預測分析，結(jié)果（圖7）顯示，該蛋白的二級結(jié)構(gòu)由50.75%的α-螺旋（alpha helix） 、34.84%的無規(guī)則卷曲（random coil）、10.32%的延伸鏈（extended strand）、4.09%的β-轉(zhuǎn)角（beta turn）組成；三級結(jié)構(gòu)結(jié)果見圖8。

2.7 TaMICU1-6A基因進化樹分析及同源氨基酸序列比對

通過NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast得到野生二粒小麥（Triticum dicoccoides）、小麥（Triticum aestivum）、烏拉爾圖小麥（Triticum urartu）、大麥（Hordeum vulgare）等物種的19 個MICU1-6A 家族蛋白的氨基酸序列，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖9），顯示TaMICU1-6A基因與野生二粒小麥、烏拉爾圖小麥、小麥親緣關(guān)系比較近。進一步利用DNAMAN將TaMICU1-6A與TaMICU1-6B、TaMICU1-6D、AtMICU、TdMICU、TaMICU、Hvs. vMICU、BdMICU、OsMICU、ZmMICU基因進行同源性比較，結(jié)果（圖10）顯示它們的同源性分別為79.82%、80.70%、39.65%、81.58%、80.70%、78.25%、74.21%、68.77%、64.21%。綜合以上分析結(jié)果，推測TaMICU1-6A與TdMICU在生物學功能上更為接近。

2.8 TaMICU1-6A基因啟動子順式作用元件分析

使用PlantCARE進行預測分析，結(jié)果（表5）顯示該啟動子含3種激素響應元件，分別是參與生長素反應的順式作用調(diào)控元件AuxRR-core、赤霉素響應元件GARE-motif、2個茉莉酸甲酯響應元件 CGTCA-motif、TGACG-motif；同時還含有3種光響應相關(guān)的反應元件G-box、Gap-box、TCCC-motif，以及1個缺氧特異性誘導的相關(guān)元件GC-motif等。說明TaMICU1-6A基因可能參與了生長素、赤霉素等信號通路，同時可能響應光照脅迫。

2.9 TaMICU1-6A基因在不同組織中的表達分析

為了分析TaMICU1-6A基因在不同組織中的表達特異性，取中國春15 d 苗齡幼苗的根、莖、葉，提取總 RNA 進行 RT-PCR 檢測，結(jié)果（圖11）顯示，TaMICU1-6A在中國春的根、莖、葉中均有表達，在葉片中的表達量較高，莖中表達量較低。

2.10 TaMICU1-6A基因在不同脅迫下的表達分析

使用實時熒光定量 PCR 技術(shù)檢測在生長素（100 μmol/L）、赤霉素（100 μmol/L）、黑暗、低溫（4 ℃）、鹽處理（200 mmol/L）等非生物脅迫下處理 0、3、6、12、24 h后小麥根、莖、葉中TaMICU1-6A基因的表達水平，以 0 h 作為對照組。由圖12可知，生長素處理下，根中表達水平顯著或極顯著下調(diào)，在12 h達到最低；莖中表達水平較0 h時極顯著下調(diào)；葉片中表達水平在3 h達到最高，在12 h達到最低。在赤霉素處理下，根中表達水平3 h較 0 h 顯著上升，其余3個時間極顯著下調(diào)；莖中表達水平在3 h達到最高，在6 h達到最低，12 h較0 h則無顯著差異；葉片中表達水平呈先升后降的趨勢，在6 h表達水平達到最高。黑暗處理下，在根、葉片中表達水平均呈先降后升的趨勢，且在6 h達到表達水平最低；在莖中，表達水平在3 h較0 h無顯著差異，在6 h表達水平最低。低溫處理下，在根、莖中表達水平呈先降再升的趨勢，根中12 h表達水平達到最低，莖中6 h表達水平達到最低；在葉片中表達水平3 h較0 h無顯著差異，其余3個時間較0 h極顯著下調(diào)。鹽處理下，在根中表達水平極顯著下調(diào)；在莖中表達水平極顯著下調(diào)且呈先降后升的趨勢；在葉片中，表達水平3 h較0 h無顯著差異，其余3個時間較0 h顯著下調(diào)。這些結(jié)果表明，TaMICU1-6A基因?qū)ιL素、赤霉素、黑暗、低溫及高鹽處理均有一定程度的響應，認為TaMICU1-6A基因通過激素信號途徑在小麥對非生物脅迫的響應過程中發(fā)揮作用。

3 討論

本研究通過克隆得到一個小麥MICU1-6A基因，該基因全長為1 398 bp，對該基因編碼蛋白進行生物信息學分析，結(jié)果表明該蛋白屬于內(nèi)在膜蛋白，定位在線粒體上，與前人報道的結(jié)果［25］相同。對TaMICU1-6A基因進行保守結(jié)構(gòu)域預測，發(fā)現(xiàn)其具有EF-hand結(jié)構(gòu)域。根據(jù)MAngale的報道，MICU1具有2個鈣離子結(jié)合EF-hand且是其行使功能的關(guān)鍵［38］。Zeng等也在大豆基因組中鑒定了至少262個編碼了不同數(shù)量EF-hand蛋白的基因，這些基因中的大多數(shù)在-1 500 bp啟動子區(qū)域中包含1個或多個激素信號或應激反應順式元件［39］。通過對TaMICU1-6A基因啟動子順式作用元件進行分析可知，其含有3種激素響應元件，同時還含有3種光響應相關(guān)的反應元件，由此推測TaMICU1-6A基因可能在響應逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。

Ca2+信號傳導在調(diào)節(jié)植物非生物脅迫相關(guān)反應中起著重要作用，植物具有各種初級感覺機制來辨別和轉(zhuǎn)化發(fā)生的物理化學變化，如滲透、鹽、溫度脅迫，一旦受到應激刺激，植物就會立即做出反應［40-41］。有研究證明，鈣結(jié)合蛋白caleosin RD20/CLO3在蛋白質(zhì)的N-末端部分含有單一的EF-hand，對rd20/clo3突變體的分析表明，rd20/clo3在控制黑暗環(huán)境中幼苗下胚軸長度的信號通路和葉片形態(tài)中起著關(guān)鍵作用［42］。對TaMICU1-6A基因在黑暗處理下不同組織表達水平進行檢驗發(fā)現(xiàn)，黑暗處理能抑制根、莖、葉中TaMICU1-6A基因的表達。鹽分脅迫是主要的非生物脅迫之一，它會干擾植物的生長和發(fā)育，擬南芥CML9敲除突變體植物對鹽和干旱表現(xiàn)出更強的耐受性［43］。對TaMICU1-6A基因在鹽處理下不同組織表達水平進行檢驗發(fā)現(xiàn)，鹽處理能抑制根、莖、葉中TaMICU1-6A基因的表達。有研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥的根中具有單一 EF-hand Ca2+結(jié)合蛋白Ca2+依賴性調(diào)節(jié)劑CMI1的表達被生長素直接上調(diào)，cmi1突變體表現(xiàn)出增強的生長素反應，包括主根變短、根毛變長、下胚軸變長、側(cè)根形成改變［44］。對TaMICU1-6A基因在IAA處理下不同組織表達水平進行檢驗發(fā)現(xiàn)，IAA處理能抑制根、莖中TaMICU1-6A基因的表達。同時 RT-qPCR 結(jié)果還顯示，低溫處理能抑制根、莖、葉中TaMICU1-6A基因的表達；GA處理整體能促進葉片中TaMICU1-6A基因的表達。由此推測，TaMICU1-6A基因可能通過IAA或者GA介導的信號途徑參與小麥的非生物脅迫，表明TaMICU1-6A基因可能通過多種激素介導的信號途徑參與到小麥在多種逆境條件下的調(diào)控過程，這為今后研究該基因功能及其在非生物脅迫下的作用機制提供了參考。

本研究克隆獲得小麥TaMICU1-6A基因的全長序列，該基因編碼465個氨基酸，通過蛋白質(zhì)氨基酸多重序列比對發(fā)現(xiàn)，其與野生二粒小麥、烏拉爾圖小麥、小麥親緣關(guān)系比較近；RT-PCR結(jié)果表明TaMICU1-6A基因具有組織特異性；RT-qPCR結(jié)果表明TaMICU1-6A基因可能通過介導IAA、GA的信號途徑響應低溫、黑暗及鹽脅迫，但具體的分子調(diào)控途徑尚不清楚，還需后續(xù)試驗進行探究。期待本研究結(jié)果可為探討TaMICU1-6A基因在小麥中的生物學功能提供一定的理論基礎(chǔ)。

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