關(guān)洪亮,熊 倩,余訓(xùn)民,李慶新
(武漢工程大學(xué)環(huán)境與城市建設(shè)學(xué)院,湖北 武漢 430074)
隨著人們對(duì)絲氨酸生理作用的深入認(rèn)識(shí)和醫(yī)藥保健事業(yè)的不斷發(fā)展,醫(yī)藥、食品、飼料等行業(yè)對(duì)絲氨酸的需求量正迅速擴(kuò)大.雖然L-絲氨酸屬于非必需氨基酸,但它卻具有許多重要的生理功能及用途,在醫(yī)藥、食品、化妝品中均有較為廣泛的應(yīng)用.因此,測(cè)定混合氨基酸中絲氨酸的含量對(duì)絲氨酸的開(kāi)發(fā)利用具有重要意義.
α-氨基酸與茚三酮在弱酸性溶液中共熱,反應(yīng)后經(jīng)失水脫羧生成氨基茚三酮,再與水合茚三酮反應(yīng)生成紫紅色或藍(lán)色物質(zhì),如圖1.脯氨酸等仲胺氨基酸與茚三酮反應(yīng)生成黃色物質(zhì).絲氨酸和茚三酮在弱酸性條件下共熱可以生成紫紅色的縮合物質(zhì)[1-3],且其顏色隨著絲氨酸的含量變化而有所不同.
圖1 α-氨基酸與茚三酮的顯色反應(yīng)Fig.1 Colour reaction of α-amino acid and ninhydrin
上述反應(yīng)生成的紫紅色縮合物顏色的深淺還與反應(yīng)的pH、顯色劑的用量、反應(yīng)的溫度及時(shí)間有關(guān).本文利用顯色反應(yīng),采用比色法定量檢測(cè)絲氨酸并探討了最佳的反應(yīng)條件.
722E可見(jiàn)光分光光度計(jì);層析濾紙;毛細(xì)管;25 μL微量進(jìn)樣器;薄層色譜展開(kāi)缸(規(guī)格100×100);干燥箱;帶塞玻璃試管(比色管).
1g/L的L-絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:稱取0.1 g絲氨酸溶于100 mL去離子水中.
展層劑:按照“正丁醇∶95%乙醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶1∶2”比例配制,均為AR.
0.1%茚三酮溶液:稱取0.1 g茚三酮溶于95%乙醇中,定容至100 mL,均為AR.
層析液(0.1%茚三酮-展層劑):每10 mL展層劑中加入2.5 mL 0.1%茚三酮溶液.
洗脫液:按照“V(0.1%CuSO4)∶V(75%乙醇)=2∶38”比例配制.稱取0.156 5 g CuSO4·5H2O溶于去離子水中,定容至100 mL,配制成0.1%CuSO4溶液.
待測(cè)樣品:氨基酸混合液,含有絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸等.
1.2.1 茚三酮法定性檢測(cè)絲氨酸 將預(yù)先配制的層析液倒入展開(kāi)缸中靜置20 min,使缸內(nèi)環(huán)境達(dá)到平衡,在距濾紙下端2 cm處劃一橫線,將待測(cè)樣品用毛細(xì)管點(diǎn)樣于橫線上,點(diǎn)樣半徑不要超過(guò)2 mm,將L-絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用毛細(xì)管點(diǎn)樣于距待測(cè)樣品點(diǎn)1.5 cm處的橫線上,點(diǎn)樣半徑不要超過(guò)2 mm.待樣液自然揮發(fā)干后傾斜放入展開(kāi)缸中,下端1 cm左右浸入層析液中,上端高出展開(kāi)缸的部分延展開(kāi)缸邊緣折疊掛于展開(kāi)缸上,確保濾紙不與展開(kāi)缸內(nèi)壁接觸,如圖2.待層析液上行至距折線1 cm左右時(shí)取出濾紙,放入105 ℃的干燥箱中干燥5 min[4].
圖2 層析示意圖Fig.2 Diagrammatic sketch of chromatography
1.2.2 茚三酮法定量檢測(cè)絲氨酸 將預(yù)先配制的層析液倒入展開(kāi)缸中靜置20 min,使缸內(nèi)環(huán)境達(dá)到平衡,在距濾紙下端2 cm處劃一橫線,用微量進(jìn)樣器取1 g/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液點(diǎn)樣于橫線
上,待樣液自然揮發(fā)干后傾斜放入展開(kāi)缸中,如圖2.待層析液上行至距折線1 cm左右時(shí)取出濾紙,放入干燥箱中,在105 ℃條件下干燥5 min.干燥后的濾紙上會(huì)呈現(xiàn)明顯的氨基酸顯色斑點(diǎn),剪下氨基酸顯色斑點(diǎn),將其放置于帶塞玻璃試管中(比色管),用4 mL洗脫液洗脫35 min,再倒入比色皿中靜置24 h(確保液體中的紙末全部沉淀),以洗脫液為對(duì)照樣,在722E分光光度計(jì)上(波長(zhǎng)570 nm處)測(cè)定吸光度[5-6].
2.1.1 溶液pH的影響 用1 mol/L的NaOH溶液和1+1的硫酸溶液將層析液分別配制成pH為1.03、2.02、2.50、3.05、4.50的溶液,用微量進(jìn)樣器取5 μL絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液點(diǎn)樣,進(jìn)行層析顯色.
由于層析液在堿性條件下分層,所以用1 mol/L的NaOH溶液和1+1的硫酸溶液將1 g/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制成pH為6.56、8.77、9.50、11.05、12.05,取5 μL點(diǎn)樣,將層析液配制成弱堿性溶液,進(jìn)行層析顯色[7].
實(shí)驗(yàn)結(jié)果歸納于表1.
表1 pH對(duì)顯色反應(yīng)的影響Table 1 pH on the colour reaction
注: 1 g/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液5 μL;105 ℃下烘干5 min;每10 mL展層劑加入2.5 mL 0.1%茚三酮溶液
由表1可知,當(dāng)溶液pH低至2.0時(shí)不顯色,從pH為2.5開(kāi)始有淡紫色出現(xiàn),但pH超過(guò)9.5時(shí)淡紅色不是很明顯,之后不再顯色,可知顯色范圍在2.50~9.50之間,α-氨基酸[1]和茚三酮的顯色反應(yīng)對(duì)介質(zhì)的pH值非常敏感.
學(xué)者研究表明:α-氨基酸和茚三酮顯色反應(yīng)中,主要的顏色產(chǎn)物均通過(guò)縮合形成.與羰基化合物和氨的衍生物之間的反應(yīng)類似,在弱酸性條件下,這種縮合反應(yīng)更容易發(fā)生[5,8],酸性條件還能減少氨基以外的其它基團(tuán)對(duì)顯色反應(yīng)的干擾,使顯色反應(yīng)生成的顏色產(chǎn)物更穩(wěn)定.強(qiáng)酸性介質(zhì)中雖然能增強(qiáng)茚三酮或1,3-茚三酮羥基的反應(yīng)能力,但在強(qiáng)酸性條件下卻降低了參與縮合反應(yīng)的氨基、羥基等新核基團(tuán)的活性,使有色的縮合產(chǎn)物形成困難而且縮合生成的顏色產(chǎn)物在強(qiáng)酸性介質(zhì)中也不穩(wěn)定.在堿性條件下,顯色反應(yīng)需加熱才能完成,而且在離熱后,空氣中的氧分子或其他氧化物容易與還原型的有色縮合產(chǎn)物發(fā)生氧化還原反應(yīng),引起顏色變化甚至褪色.又因在堿性介質(zhì)中,很多基團(tuán)或化合物的還原能力得到加強(qiáng),擴(kuò)大了茚三酮的顯色反應(yīng)范圍,使得副反應(yīng)增多,從而使反應(yīng)、反應(yīng)產(chǎn)物及產(chǎn)物顏色變得復(fù)雜化,在分子內(nèi)部因素和外來(lái)因素的雙重影響和干擾下,不利于茚三酮對(duì)α-氨基酸的檢驗(yàn)和測(cè)定,并且堿性介質(zhì)中顏色的不穩(wěn)定也妨礙了對(duì)α-氨基酸的準(zhǔn)確分析[5].
綜上所述,α-氨基酸和茚三酮的顯色反應(yīng)宜在弱酸性下進(jìn)行.因此,本實(shí)驗(yàn)中選定層析液的pH為4.50左右.
2.1.2 顯色劑用量的影響 取8組20 mL配制好的展層劑,分別加入0.4、1.2、2.0、2.8、3.6、4.4、5.2、6.0 mL 0.1%茚三酮溶液,作為層析液,調(diào)節(jié)層析液pH至4.50左右.用微量進(jìn)樣器取1 g/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液15 μL點(diǎn)樣于濾紙上,進(jìn)行層析[9-10].按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定每個(gè)顯色體系的吸光度并繪制成圖,結(jié)果見(jiàn)圖3.
圖3 顯色劑用量對(duì)吸光度的影響Fig.3 Dosage of chromogenic agent on absorbance
由圖3可看出,吸光度開(kāi)始時(shí)隨著顯色劑用量的增加而增大,然后趨于平衡.當(dāng)顯色劑用量為2.2 mL時(shí),吸光度上升到最大,之后再增加顯色劑用量,吸光度基本無(wú)明顯變化,因此顯色劑用量為2.2 mL時(shí)最佳.因此,本實(shí)驗(yàn)中選擇每10 mL展層劑中加入2.5 mL顯色劑.
2.1.3 反應(yīng)溫度及時(shí)間的影響 反應(yīng)需在加熱狀態(tài)下進(jìn)行,因此反應(yīng)溫度及時(shí)間對(duì)顯色效果也存在較大影響.取4組20 mL展層劑,分別加入5 mL顯色劑并調(diào)節(jié)pH至4.50左右.用微量進(jìn)樣器取1 g/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液15 μL點(diǎn)樣于濾紙上,進(jìn)行層析[7].分別放入105、90、75、60 ℃的溫度下顯色,結(jié)果見(jiàn)表2.
表2 反應(yīng)溫度及時(shí)間對(duì)顯色效果的影響Table 2 Reaction temperature and time on colour effects
注: 絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為1 g/L;每10 mL展層劑中有2.5 mL顯色劑.
由表2可知,當(dāng)溫度為60 ℃時(shí),即使加熱13 min以上也只顯出淡紫色;溫度為75 ℃時(shí),加熱7.5 min才出現(xiàn)顏色變化;溫度為90 ℃時(shí),加熱6.5 min就有顏色變化;當(dāng)溫度上升到105 ℃時(shí),加熱3.7 min即出現(xiàn)明顯的顏色變化.綜合各方面的考慮,反應(yīng)的最佳條件應(yīng)選在105 ℃下加熱4~5 min.若加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致顯色斑點(diǎn)顏色擴(kuò)散,影響吸光度的測(cè)定.
2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取5組20 mL層析液,pH調(diào)至4.55,用微量進(jìn)樣器分別取1 g/L絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液5、10、15、20、25 μL點(diǎn)樣于層析濾紙上,按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),測(cè)定吸光度,以標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量與吸光度做絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線[10],見(jiàn)圖4.
圖4 絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of serine
從圖4可知,絲氨酸用量與吸光度呈線性關(guān)系,其回歸線方程為y=0.001 7x-0.000 2,相關(guān)系數(shù)R2=0.993 8.
2.2.2 測(cè)定方法的精密度 精密度[11]一般用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)表示.
取一定量的絲氨酸溶液,按照實(shí)驗(yàn)方法,進(jìn)行多次比色測(cè)定(n=5),計(jì)算絲氨酸含量,結(jié)果見(jiàn)表3.
表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Repetitive experimental results
注: pH為4.55;105 ℃下烘干5 min;每10 mL展層劑加入2.5 mL 0.1%茚三酮溶液.
由此可見(jiàn),此測(cè)定方法的重復(fù)性較好,精密度較高,比較可靠.
茚三酮比色法定量檢測(cè)絲氨酸操作簡(jiǎn)單、成本低.只要控制好實(shí)驗(yàn)條件,就能取得較好的測(cè)量結(jié)果.本文探討了溶液pH、顯色劑用量、反應(yīng)溫度及時(shí)間對(duì)茚三酮比色法定量檢測(cè)絲氨酸的影響,測(cè)定了絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到了最佳實(shí)驗(yàn)條件:溶液pH為4.50,顯色劑用量為每10 mL展層劑中加入2.5 mL 0.1%茚三酮顯色劑,在105 ℃下加熱5 min.
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