王蘭萍，耿榮慶，常 洪，冀德君，李永紅，常春芳

（1.鹽城師范學院 生命科學與技術(shù)學院，江蘇 鹽城224051；2.揚州大學 動物科學與技術(shù)學院，江蘇 揚州225009）

牦牛是高寒地區(qū)特有牛種，主要繁衍生息在我國青藏高原及周圍3 000 m以上的高寒地區(qū)，善走陡坡險路和雪山沼澤，能游渡江河激流，有“高原之舟”之稱。牦牛分為野牦牛（Bos grunniens mutus）和家牦牛（Bos grunniens），在動物分類學上隸屬于偶蹄目（Artiodactyla）、反芻亞目（Ruminatia）、?？疲˙ovidae）和牛亞科（Bovinae），但牦牛在屬級分類地位上尚無統(tǒng)一定論［1-10］。巴州牦牛產(chǎn)區(qū)位于新疆維吾爾自治區(qū)東南部，天山南麓，阿爾金山北麓，其中心產(chǎn)區(qū)位于巴音郭楞蒙古自治州和靜縣及和碩縣的高山地帶，以和靜的巴音布魯克、巴倫臺地區(qū)為集中產(chǎn)區(qū)。巴州牦牛是在產(chǎn)區(qū)特定自然條件下，適應高寒草甸草原和高寒草場環(huán)境，經(jīng)過當?shù)孛晒抛迥撩耖L期選育形成的牦牛類群，為牧民生產(chǎn)乳、肉、毛、皮等產(chǎn)品，是當?shù)匦竽翗I(yè)經(jīng)濟中重要的畜種。

本研究在測定新疆巴州牦牛種群線粒體Cyt b基因全長序列的基礎上，分析種群的遺傳多樣性水平，并引用其它牛種的Cyt b基因序列，探討新疆巴州牦牛的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為種質(zhì)資源的保護和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

在新疆維吾爾自治區(qū)和靜縣巴音布魯克地區(qū)，以中心產(chǎn)區(qū)典型群簡單隨機抽樣方法，采集17頭巴州牦牛（Bos grunniens）血液樣本，頸靜脈抽取血樣，肝素鈉溶液抗凝。采集的抗凝血樣于-70℃冷凍保存。

1.2 總DNA提取、PCR擴增及測序

采用苯酚-氯仿法提取血液樣本總DNA，TE溶解后-20℃保存。

以牛線粒體基因組序列（GenBank登錄號NC＿006853）設計引物用于Cyt b基因全序列擴增。上、下 游 引 物 分 別 為：P1 5′-CCATAAATAGGT GAAGGTTTGG-3＇和P2 5′-TTGATGGTGAGAC TGCAGTT-3′。引物委托上海生工生物工程有限公司合成。

PCR擴增體系為50μL體積，包括10×Buffer 5μL，25mmol／L MgCl24μL，2.5 mmol／L d NTPs 4μL，10 pmol／μL 上、下游引物各1μL，5 U／μL Taq DNA 聚合酶0.3μL，100 ng／μL DNA模板1 μL，剩余體積用滅菌超純水補足。PCR擴增程序為：95℃預變性2 min；94℃變性40 s、55℃退火40 s，72℃延伸90 s，共32個循環(huán)；72℃延伸8 min，4℃保存。

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，用凝膠回收試劑盒回收純化，直接送上海生工生物工程有限公司雙向測序。

1.3 序列數(shù)據(jù)處理與分析

所有序列使用DNAstar軟件編輯、校對和排序，根據(jù)測序峰圖輔以手工調(diào)整。DnaSP4.0［11］軟件計算群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性。以Clustal X1.83［12］軟件進行多序列比對，系統(tǒng)發(fā)育分析采用 MEGA5.0軟件［13］，分別用鄰接法（Neighbor joining，NJ）和最大簡約法（Maximum parsimony，MP）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，自展法（Bootstrap analysis）1000次重復抽樣估計系統(tǒng)樹中結(jié)點的置信值。

除了本次測定的巴州牦牛Cyt b基因單倍型序列以外，用于構(gòu)建系統(tǒng)進化樹的序列還包括另外兩部分：一是本實驗測定的普通牛（GenBank登錄號EU807948）、瘤牛（GenBank登錄號EU096518）、大額牛（GenBank登錄號EU807956）、亞洲水牛（Gen-Bank登錄號EU807960）Cyt b基因單倍型序列，另一部分引用新疆野牦牛（GenBank登錄號AY955225、AY955226）、牦 牛 （GenBank 登 錄 號AY684273、AY374124、GQ464246、GQ464248、GQ464252、GQ464256、GQ464258、GQ464259、GQ464266、GQ464305、GQ464310、JF946750）、林牛（GenBank登錄號 AY689189）、印度野牛（Gen-Bank登錄號GU324988）、爪哇牛（GenBank登錄號DQ459558）、歐洲野牛（GenBank登錄號 Y15005）、美洲野牛（GenBank登錄號AF036273）和非洲水牛（Gen Bank登錄號D82888）等牛種Cyt b基因單倍型序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cyt b基因序列特征和單倍型分布

對測序獲得的巴州牦牛線粒體Cyt b基因序列比對分析后，去除首尾兩端測序堿基序列，獲得用于分析的Cyt b基因序列全長均為1 140 bp。17頭巴州牦牛個體中共檢測到4種單倍型類型（表1），單倍型多樣性為0.331，核苷酸多樣性為0.00102。

表1 巴州牦牛Cyt b基因單倍型及其變異特征Table 1 Haplotypes and variation characteristics of Cyt b gene of Bazhou yak

2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

以不同牛種的線粒體Cyt b基因單倍型序列為基礎數(shù)據(jù)，采用Kimura雙參數(shù)模型，使用NJ法和MP法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹（圖1）。NJ法和MP法構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹的拓撲結(jié)構(gòu)基本一致，巴州牦牛Cyt b基因的4種單倍型明顯有兩個分支，一支（Gen Bank 登 錄 號 EU807949、EU807950、EU807951）是與其它家牦牛的單倍型聚在一起，另一支（GenBank登錄號EU807952）與新疆野牦牛的單倍型聚在一起，而且具有較高的自展置信值支持（NJ樹中為99，NP樹中為73），表明新疆巴州牦牛有2個母系起源。

3 討 論

基于線粒體Cyt b基因部分序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，巴州牦牛可能具有2種母系起源［14］。本研究的結(jié)果顯示，從線粒體遺傳的角度來看，巴州牦牛有2個母系起源，一類擁有家牦牛血統(tǒng)，另一類擁有野牦牛血統(tǒng)。巴州牦牛與新疆野牦牛線粒體Cyt b基因共同聚為一類，可能存在兩種原因：一種是兩者在較早的世代具有共同的祖先，使得它們曾經(jīng)擁有共同的祖先序列，并且在漫長的進化歷程中巴州牦牛仍然保留著祖先序列的基本特征；另一種推測是野牦牛到巴州牦牛可能存在著線粒體DNA漸滲。

對于家牦牛的起源，各國學者都比較認同牦牛的單一起源學說，即原始牦牛是家牦牛和野牦牛的共同祖先，現(xiàn)在的家養(yǎng)牦牛是由野牦牛馴化而來［15-17］。因此，巴州牦牛與新疆野牦牛完全可能擁有早期共同祖先的線粒體序列特征，從而與本研究的聚類結(jié)果相吻合。

為了提高生產(chǎn)性能和改進遺傳品質(zhì)，在巴州牦牛的改良過程中，曾經(jīng)實施過引進野牦牛凍精、捕捉野牦牛犢牛進行人工飼養(yǎng)馴化與雜交改良以及巴州半野血牦牛良種繁育基地等項目，而且在部分地區(qū)經(jīng)常發(fā)生公野牦牛進入家養(yǎng)牦牛群中配種的事例［18］。這些為野牦牛與巴州牦牛的線粒體DNA漸滲提供了可能，使得出現(xiàn)巴州牦牛與新疆野牦牛線粒體Cyt b基因聚為一類的現(xiàn)象。

圖1 基于Cyt b基因單倍型構(gòu)建的牛種間分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.1 The molecular phylogenetic trees based on haplotypes of Cyt b gene of bovine species

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