王 健，孫 瑜，陳雙璐，林 宏

(1.天津市兒童醫(yī)院，天津 300074;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

小兒抗病毒顆粒是以本院老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)處方為基礎(chǔ)，經(jīng)改良制備工藝后制成的醫(yī)院制劑，由黃芩、金銀花、陳皮、連翹、天花粉、石膏等中藥組成，具有清熱解表，止咳定喘之功效，臨床用于治療感冒發(fā)燒，有汗或無汗，鼻流清涕及病毒性肺炎。黃芩苷為黃芩的有效成分，橙皮苷為陳皮的有效成分［1］，測定兩者的含量可有效控制該制劑的質(zhì)量。本文建立了一種采用高效液相色譜同時(shí)測定黃芩苷和橙皮苷含量的方法。該方法簡便、準(zhǔn)確，可靠，適用于本制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC－2010A高效液相色譜儀，紫外檢測器，Lcsolution工作站(日本島津公司);EQAS1000GVDE型雙頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，十萬分之一天平(梅特勒－托利多公司)，RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 試藥 黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110715－200815)，橙皮苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110721－200613);乙腈(天津市康科德科技有限公司)、磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)均為色譜純;水為純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司);其余試劑均為分析純。小兒抗病毒顆粒(本院院內(nèi)制劑，批號20110101、20110201、20110301);陰性對照品為自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Shim－pack VP－ODSC18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈－水－磷酸(21∶79∶0.1);流速:1.0 m l/min;柱溫:40 ℃;檢測波長:283 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取黃芩苷對照品 2.25 mg、橙皮苷 1.30 mg，置 50 ml量瓶中，加入稀乙醇(按照《中國藥典》2010年版一部附錄配制)30 m l，超聲15 min使溶解，取出，放冷，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別制成含黃芩苷45μg/ml、橙皮苷26 μg/ml的對照品溶液。

2.2.2 樣品溶液的制備 將樣品置于研缽中，研細(xì)，取約1 g，置100 ml量瓶中，加入稀乙醇適量超聲處理(功率300 W，頻率45 kHz)60 min，取出，放置至室溫，再加稀乙醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 取除黃芩、陳皮外的處方量藥材，按制備工藝制備不含黃芩、陳皮的陰性樣品，再按上述樣品溶液制備方法，制成不含黃芩、陳皮的陰性溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密吸取對照品溶液、樣品溶液、陰性樣品溶液各10μl，注入液相色譜儀測定。結(jié)果表明，樣品溶液與對照品溶液出現(xiàn)保留時(shí)間相同的色譜峰，而陰性樣品溶液在相同保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn)，證明其他輔料成分對測定結(jié)果無干擾。見圖1。橙皮苷與黃芩苷的保留時(shí)間分別為 8.720和16.778，分離度 R≥1.5，滿足含量測定要求。

圖1 橙皮苷對照品(A)黃芩苷對照品(B)樣品(C)陰性樣品(D)高效液相色譜圖

2.4 線性關(guān)系考查 分別吸取黃芩苷對照品溶液(45 μg/ml)6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 和 16.0 μl，橙皮苷對照品溶液(26 μg/ml)10.0、12.0、14.0、16.0、18.0和20.0 μl依次注入高效液相色譜儀，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積。以對照品的濃度為橫坐標(biāo)(X)，以測得的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸分析，得黃芩苷的回歸方程為:Y=2 849 744.13 X－13 379(r=0.999 96)，橙皮苷的回歸方程為:Y=1 296 514.8 X －663.9(r=0.999 97)，表明黃芩苷在0.270 ～0.720 mg/ml范圍內(nèi)、橙皮苷在0.260 ～0.520 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 分別取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μl，測定峰面積，橙皮苷RSD為0.41%、黃芩苷RSD為0.30%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號的樣品(批號20110301)適量，按照“2.2.2”項(xiàng)下樣品溶液制備操作，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件分析，分別在 0、2、4、6、8 和10 h進(jìn)樣10μl，測定峰面積，橙皮苷RSD為0.77%、黃芩苷RSD為0.51%，表明10 h內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號的樣品(批號20110301)6份，按照“2.2.2”項(xiàng)下樣品溶液制備操作，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，每次進(jìn)樣量為10μl，測定樣品含量。結(jié)果:橙皮苷平均含量4.145 mg/g、RSD為 0.81%;黃芩苷平均含量 5.586 mg/g、RSD 為0.35%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密稱取橙皮苷與黃芩苷對照品適量，加稀乙醇制成濃度分別為0.1051、0.1400 mg/ml的溶液;另取本品約 0.25 g，精密稱定，置50 ml量瓶中，各6份，加入稀乙醇30 ml，再精密加入上述黃芩苷的稀乙醇溶液10 ml，超聲處理30 min，放置至室溫，加稀乙醇至刻度，搖勻，濾過。取續(xù)濾液，制得供加樣回收試驗(yàn)用供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析測定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為:橙皮苷99.73%(RSD 為 1.52%)、黃芩苷 101.8%(RSD 為0.63%)。結(jié)果見表1和表2。

表1 橙皮苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測定 取3批小兒抗病毒顆粒樣品(批號為20110101、20110201、20110301)，按照“2.2.2”項(xiàng)樣品溶液制備操作，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分析測定，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表2 黃芩苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表3 樣品中橙皮苷與黃芩苷含量

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)參考大量文獻(xiàn)［2－5］，試用了不同的流動(dòng)相，分別使用了甲醇 －水 －磷酸(44∶56∶0.2)、乙腈 －水 － 磷酸(20∶80∶0.1)及乙腈－水－磷酸(22∶78∶0.1)作為流動(dòng)相，其橙皮苷或黃芩苷的保留時(shí)間不是很恰當(dāng)，理論塔板數(shù)較低，且所呈現(xiàn)的圖像中橙皮苷峰前有小的雜質(zhì)峰，分離度不好。后選用乙腈－水－磷酸(21∶79∶0.1)理論塔板數(shù)提高，橙皮苷峰與雜質(zhì)峰基本分離，且橙皮苷與黃芩苷峰的Rf值≥1.5，符合《中國藥典》的要求，保留時(shí)間適中，其他成分幾乎無干擾。故選此比例為流動(dòng)相。

3.2 檢測波長的選擇 黃芩苷與橙皮苷在《中國藥典》測定方法中檢測波長分別為280 nm及283 nm，由于樣品中橙皮苷的含量較黃芩苷少，為了提高橙皮苷的檢測靈敏度，故選用283 nm作為檢測波長。

3.3 溶劑和提取方法的選擇 試用稀乙醇、70%甲醇進(jìn)行樣品中橙皮苷與黃芩苷的提取，結(jié)果兩種成分的保留時(shí)間與峰面積相差甚微，由于稀乙醇毒性低，故本實(shí)驗(yàn)選用稀乙醇;同時(shí)考查了不同提取方法如加熱回流法與超聲法、及超聲時(shí)間(30、45、60和90 min)長短對含量的影響，結(jié)果表明加熱回流、超聲60 min所得樣品含量無差異，由于超聲方法的簡便、易操作性，故選擇超聲法。從超聲時(shí)間長短來看，時(shí)間為60 min提取的更完全，故時(shí)間選定為60 min。

1 中國藥典［S］.一部.2010:176

2 田玉清，王剛，趙才德.高效液相色譜法測定胃康膠囊中橙皮苷的含量［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2010，24(3):63

3 劉平，王艷君.HPLC法測定開光復(fù)明片中黃芩苷的含量［J］.中國藥房，2007，18(27):2131

4 余琰，焦海勝，馬立新.HPLC同時(shí)測定清氣化痰丸中橙皮苷和黃芩苷的含量［J］.中成藥，2005，27(8)，894

5 譚生建，劉剛，姜韌.高效液相色譜法測定枳實(shí)導(dǎo)滯丸中橙皮苷和黃芩苷含量［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22(5)，387