馬 妍 ，郭利平

1天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193；2天津中醫(yī)藥大學(xué)?？滇t(yī)院

近年來研究發(fā)現(xiàn)反復(fù)短暫的心肌缺血可以使心肌對(duì)隨后長時(shí)間的缺血再灌注損傷產(chǎn)生明顯的耐受力，即缺血預(yù)適應(yīng)現(xiàn)象(IPC)。IPC的保護(hù)作用包括預(yù)適應(yīng)后立即產(chǎn)生持續(xù)1～3小時(shí)的早期保護(hù)作用與預(yù)適應(yīng)后24小時(shí)出現(xiàn)持續(xù)3～4天的延遲保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)許多中藥對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有與IPC同等的保護(hù)作用［1］。IPC與中藥預(yù)適應(yīng)的作用不僅在動(dòng)物體內(nèi)得到證實(shí)，在離體實(shí)驗(yàn)研究中，通過應(yīng)用缺氧預(yù)適應(yīng)細(xì)胞模型［2］與缺氧復(fù)氧細(xì)胞模型分別模擬IPC與缺血再灌注損傷，證實(shí)經(jīng)過缺血預(yù)適應(yīng)或中藥預(yù)適應(yīng)的心肌細(xì)胞可對(duì)抗缺氧復(fù)氧損傷，內(nèi)皮細(xì)胞亦具有相同作用。但是由心肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共同組成的心臟內(nèi)環(huán)境中，是如何相互作用，中藥預(yù)適應(yīng)在其中會(huì)產(chǎn)生怎樣的影響，有待進(jìn)一步研究。芪參益氣滴丸具有益氣通脈、活血止痛之功效，在冠心病防治方面發(fā)揮著重要作用，國家“十五”科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目“芪參益氣滴丸對(duì)心肌梗死二級(jí)預(yù)防的臨床試驗(yàn)研究”的初步結(jié)果表明。芪參益氣滴丸在心肌梗死的二級(jí)預(yù)防中顯示出良好的效果［3］。本研究利用transwel l小室建立CMEC與CMC共培養(yǎng)體系，模擬心臟內(nèi)環(huán)境，并且利用芪參益氣滴丸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行預(yù)適應(yīng)，觀察其對(duì)心肌細(xì)胞的延遲保護(hù)作用，并探討CMEC與CMC的相互作用。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar乳鼠(3d內(nèi))，雌雄不拘［中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-(軍)2009-003］；胰蛋白酶(Sigma)；Ⅱ型膠原酶(Sigma)；DMEM-F12(Hyclone)；胎牛血清(Bioind)；5-溴脫氧尿嘧啶(Sigma)；0.25%胰酶(Hyclone)；雙抗(青、鏈霉素)；PBS緩沖液(PH7.2～7.4)；芪參益氣滴丸溶液(由天津天士力集團(tuán)提供中藥浸膏，按一定比例于完全培養(yǎng)基中混合溶解而成）；Transwel l小室(24 wel l，膜孔徑 0.4μm，康寧 3470)；細(xì)胞增殖/毒性檢測(CCK-8)試劑盒(同仁化學(xué)研究所，日本)；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(北京中生生物工程高技術(shù)公司)；丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；超氧化物酶歧化酶(SOD)WST-1法測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)；厭氧培養(yǎng)箱(Thermo)；倒置相差光學(xué)顯微鏡(Leica)；新穎立式小容量恒溫?fù)u床 (上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(Beckman)；全自動(dòng)生化分析儀(日立 7020型，日本)；多功能讀板機(jī)(Tecan，瑞士)。

1.2 原代培養(yǎng) 無菌環(huán)境下，取乳鼠于75%酒精中浸泡5～6 s后置于培養(yǎng)皿中，開胸暴露心臟，于心臟收縮期剪下心臟放于預(yù)冷的PBS緩沖液中(含1%雙抗)，留取心尖，將心尖組織移至錐形瓶瓶口剪碎，加入混合酶5mL(0.1%膠原酶與0.06%胰蛋白酶)于恒溫?fù)u床37℃，轉(zhuǎn)速110 r/min震蕩5分鐘，第一次消化后棄上清，之后每次消化后需收集上清液，經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾至預(yù)冷的50mL離心管(提前加入5mL全培)，如此反復(fù)消化4-5次至組織成半透明狀時(shí)終止；將收集的液體以1 000 r/min、10分鐘離心后棄上清液，加入適量全培重懸細(xì)胞沉淀，將混勻的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入75 cm2培養(yǎng)瓶中，差速培養(yǎng)90分鐘后取出，將培養(yǎng)瓶中細(xì)胞懸液倒入加樣槽，加終濃度為0.1 mmol/L 5-溴脫氧尿嘧啶，吹勻后繼續(xù)移入75 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，差速培養(yǎng)后75 cm2培養(yǎng)瓶中貼壁細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞，加入適量全培繼續(xù)培養(yǎng)。傳代：將原代心肌培養(yǎng)3天后，鏡下觀察心肌成簇狀或單層，搏動(dòng)，頻率為80～120次/min，傳代時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加適量PBS清洗3次，加4mL0.25%胰酶，鏡下觀察1分鐘至細(xì)胞大部分收縮，拍打培養(yǎng)瓶底部，細(xì)胞脫落后迅速倒入離心管(提前加入5mL全培)，離心 800 r/min，8分鐘，棄上清，以全培重懸細(xì)胞，此為第一代細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞傳代過程與心肌細(xì)胞基本相同，本實(shí)驗(yàn)用第一代心肌細(xì)胞及穩(wěn)定生長的第三代內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 分組 將心肌細(xì)胞分為6組，其中4組嵌套種有內(nèi)皮細(xì)胞的t raswel l小室組成共培養(yǎng)模型，分別為心肌細(xì)胞正常組(Cont rol-cm)，心肌細(xì)胞損傷組(H/R-cm)，共培養(yǎng)正常組(Cont rol)、共培養(yǎng)損傷組(H/R)、共培養(yǎng)中藥預(yù)適應(yīng)組(QSYQ)、共培養(yǎng)缺氧預(yù)適應(yīng)組(HPC)。

1.4 步驟 將心肌細(xì)胞以密度2.5×105個(gè)/mL種于24孔板，分6組。將內(nèi)皮細(xì)胞以2×105個(gè)/mL種于Transwel l嵌套小室內(nèi)底面［4］，分4組。48小時(shí)后鏡下觀察心肌細(xì)胞，24小時(shí)后鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞狀態(tài)良好，同時(shí)同步24小時(shí)。同步后，各組實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1.4.1 Cont rol-cm組 換液，于正常孵箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，繼續(xù)培養(yǎng)28小時(shí)(與H/R同步進(jìn)行，缺氧箱降到O2＜1%約2h)，取上清液待測。

1.4.2 H/R-cm組 換液，于正常孵箱中培養(yǎng)24小時(shí)后放入缺氧箱中缺氧24小時(shí)，復(fù)氧2小時(shí)，取上清液待測。

1.4.3 Control組 取未處理的一組內(nèi)皮細(xì)胞，換新鮮培養(yǎng)液并將嵌套小室放入相應(yīng)心肌細(xì)胞孔中，完成共培養(yǎng)體系，于正常孵箱中共培養(yǎng)24小時(shí)后，繼續(xù)培養(yǎng)28小時(shí)，取上清液待測。

1.4.4 H/R組 取未處理的一組內(nèi)皮細(xì)胞，換新鮮培養(yǎng)液并將嵌套小室放入相應(yīng)心肌細(xì)胞孔中，完成共培養(yǎng)體系，于正常孵箱中共培養(yǎng)24小時(shí)后，放入缺氧箱中缺氧24小時(shí)，復(fù)氧2小時(shí)，取上清液待測。

1.4.5 QSYQ組 取一組內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)QSYQ預(yù)適應(yīng)1小時(shí)后，將培養(yǎng)液與嵌套小室一同放入相應(yīng)心肌細(xì)胞孔中，完成共培養(yǎng)體系，于正常孵箱中共培養(yǎng)24小時(shí)后，放入缺氧箱中缺氧24小時(shí)，復(fù)氧2小時(shí)，取上清液待測。

1.4.6 HPC組 取一組內(nèi)皮細(xì)胞先于缺氧箱中缺氧40分鐘，復(fù)氧40分鐘后，將培養(yǎng)液與嵌套小室一同放入相應(yīng)心肌細(xì)胞孔中，完成共培養(yǎng)體系，于正常孵箱中共培養(yǎng)24小時(shí)后，再次放入缺氧箱中缺氧24小時(shí)，復(fù)氧2小時(shí)，取上清液待測。

1.5 檢測方法 以CCK-8、SOD評(píng)價(jià)細(xì)胞活力，以LDH、MDA評(píng)價(jià)細(xì)胞損傷程度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(χ±s)表示，采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞 CCK-8、SOD、LDH、MDA比較 Cont rol組心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力更好，CCK-8、SOD升高(P＜0.05)；損傷相對(duì)減少，LDH下降(P＜0.05)，MDA釋放量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表 1 心肌細(xì)胞 CCK-8、SOD、LDH、MDA比較(χ±s)

2.2 與H/R組比較 H/R-cm組心肌細(xì)胞活力更低，CCK-8與SOD均下降，損傷更加嚴(yán)重，LDH與MDA均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；H/R組與Cont rol組比較，細(xì)胞處于損傷狀態(tài)，達(dá)到損傷效果，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；經(jīng)過QSYQ預(yù)適應(yīng)的內(nèi)皮細(xì)胞與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)后(QSYQ組)，心肌細(xì)胞活力高于H/R組，CCK-8與SOD升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與Cont rol組相當(dāng)甚至高于Control組；心肌細(xì)胞損傷程度低于H/R組，LDH與MDA升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；經(jīng)HPC處理的內(nèi)皮細(xì)胞與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)后(HPC組)，心肌細(xì)胞亦表現(xiàn)出對(duì)長時(shí)間缺氧損傷的耐受力，細(xì)胞活力高，損傷程度?。籕SYQ組與HPC組細(xì)胞活力與損傷程度基本相當(dāng)，見表1。

3 討論

20世紀(jì)80年代后期，研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)［5］。體外細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立，可最大程度地模擬體內(nèi)環(huán)境，進(jìn)而觀察細(xì)胞之間的相互作用。以往研究表明，在心臟的生長發(fā)育、收縮活動(dòng)及各項(xiàng)生理功能中，心臟內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的自分泌、旁分泌因子以及細(xì)胞因子都起著十分重要的調(diào)控作用［6］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用t ranswel l小室建立了心肌細(xì)胞(CMC)與心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMEC)的共培養(yǎng)體系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在正常培養(yǎng)情況下，與CMEC共培養(yǎng)的心肌細(xì)胞較單一心肌細(xì)胞細(xì)胞活力更好，而在經(jīng)過相同長時(shí)間缺氧條件下，與CMEC共培養(yǎng)的心肌細(xì)胞表現(xiàn)出損傷程度較小的優(yōu)勢，說明共培養(yǎng)體系體現(xiàn)了CMEC與CMC的相互作用，而且共培養(yǎng)的細(xì)胞環(huán)境較單一細(xì)胞更接近心臟內(nèi)環(huán)境條件。

在建立了CMC與CMEC共培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)初步探索經(jīng)過中藥預(yù)適應(yīng)的CMEC對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)芪參益氣滴丸預(yù)適應(yīng)的CMEC與經(jīng)過缺氧預(yù)適應(yīng)的CMEC對(duì)心肌細(xì)胞長時(shí)間缺氧損傷方面表現(xiàn)出了同樣的延遲保護(hù)作用。芪參益氣滴丸由黃芪、丹參、三七、降香油4味藥物組成，主治氣虛血瘀型胸痹心痛，劑型穩(wěn)定，療效可靠，是已經(jīng)上市的中成藥，也是體現(xiàn)中醫(yī)診治冠心病特色和優(yōu)勢的代表藥物之一。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)CMEC進(jìn)行芪參益氣滴丸預(yù)適應(yīng)，發(fā)現(xiàn)對(duì)心肌細(xì)胞同樣具有保護(hù)作用。基于心肌缺血預(yù)適應(yīng)的作用機(jī)制［7］，本研究發(fā)現(xiàn)芪參益氣滴丸中的丹參成分主要為脂溶性丹參酮和水溶性丹酚酸兩大類［8］，有研究顯示丹參酮ⅡA能增加內(nèi)皮細(xì)胞NO的分泌［9］，同時(shí)缺血預(yù)適應(yīng)是通過NO介導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)心肌的延遲保護(hù)［10-11］。由此可以推測中藥預(yù)適應(yīng)的作用機(jī)制可能是CMEC預(yù)適應(yīng)后產(chǎn)生大量內(nèi)源活性物質(zhì)分泌到共培養(yǎng)的環(huán)境中，這些內(nèi)源活性物質(zhì)同NO一樣在某個(gè)環(huán)節(jié)中激發(fā)了心肌細(xì)胞的預(yù)適應(yīng)系統(tǒng)，從而對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生作用，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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