腦蛋白水解物對小鼠記憶鞏固能力的影響及機(jī)制

魏婧馬玉玲邵曉彤宋丹丹王廣紅陳麗娜安麗萍杜培革

(北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林吉林132013)

摘要〔〕目的觀察腦蛋白水解物對記憶鞏固障礙模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，探討其可能的作用機(jī)制。方法采用跳臺法觀察腦蛋白水解物對亞硝酸鈉記憶鞏固障礙模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，測定小鼠血清丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性與腦組織乙酰膽堿酯酶(AChE)、Na+-K+-ATP、γ氨基丁酸酯(GABA)、MDA含量和SOD活性，并觀察小鼠腦組織海馬區(qū)病理形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果腦蛋白水解物能延長小鼠潛伏期，減少錯誤次數(shù)；降低血清MDA含量，升高血清SOD活性；降低腦組織Na+-K+-ATP和AChE含量，升高GABA含量；腦蛋白水解物對正常小鼠腦組織形態(tài)學(xué)無明顯影響，對記憶鞏固障礙模型小鼠腦組織有不同程度的修復(fù)作用。結(jié)論腦蛋白水解物能增強(qiáng)正常小鼠、改善亞硝酸鈉記憶鞏固障礙模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，可能與其減少自由基損傷有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕腦蛋白水解物；記憶鞏固；亞硝酸鈉

中圖分類號〔〕R96〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

基金項(xiàng)目：吉林省衛(wèi)生計生科研計劃項(xiàng)目(20142088)；吉林省生物大分子功能開發(fā)與應(yīng)用工程實(shí)驗(yàn)室自主創(chuàng)新能力建設(shè)項(xiàng)目

通訊作者：杜培革(1963-)，女，教授，主要從事生物大分子功能開發(fā)與應(yīng)用方向研究。

第一作者：魏婧(1989-)，女，碩士，主要從事生物大分子功能開發(fā)與應(yīng)用方向研究。

腦蛋白水解物是豬腦組織的提取物，含神經(jīng)營養(yǎng)因子、分子肽、氨基酸等活性成分〔1〕。研究表明，腦蛋白水解物易跨越血腦屏障，參與體內(nèi)氧化，增加腦活性〔2〕；作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受缺血、低氧、神經(jīng)毒素等損害〔3~6〕。目前，腦蛋白水解物片劑、注射液等治療阿爾茨海默病(AD)、急性腦出血所致的神經(jīng)功能障礙取得了良好療效〔7~9〕，但少有提高和改善學(xué)習(xí)記憶力的研究。記憶鞏固是貯存大腦記憶痕跡使記憶加深，最后貯存于腦的過程〔8〕，是學(xué)習(xí)記憶的重要過程。本文旨在研究腦蛋白水解物對亞硝酸鈉所致記憶鞏固障礙小鼠的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物ICR小鼠140只，雄性，體重(18±2)g，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2腦蛋白水解物取新鮮豬腦，勻漿，胃蛋白酶酶解，取上清液經(jīng)超濾、納濾除雜后噴霧干燥，即得。

1.3試劑與儀器吡拉西坦(東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司，批號：20120804)，亞硝酸鈉(沈陽市華東試劑廠，批號：20120901)，乙酰膽堿酯酶(AChE)測定試劑盒、γ-氨基丁酸酯(GABA)測定試劑盒、Na+-K+-ATP酶測定試劑盒(上海尚樂生物制品研究所)，丙二醛(MDA)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(南京建成生物制品研究所，批號：20140109)。

電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，AL204)，恒溫生化培養(yǎng)箱(上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，SPX-250B-Z)，低溫高速離心機(jī)(美國Eppendorf Centrifuge公司，5430R)，手提式高速分離器(寧波新芝生物科技股份有限公司S10)；紫外可見分光光度計(島津國際貿(mào)易有限公司UV-2550)，恒溫水浴鍋(北京長安科學(xué)儀器廠)，DT-200小鼠跳臺測試箱(成都泰盟科技有限公司)，酶標(biāo)儀(TECAN Infinite M200)。

1.4動物分組實(shí)驗(yàn)動物分為正常+對照組(NC)(予蒸餾水0.2 ml/d)、正常+陽性藥組(NP)(予吡拉西坦540 mg·kg-1·d-1)、正常+腦蛋白高劑量組(NH)(予腦蛋白水解物210 mg·kg-1·d-1)、正常+腦蛋白中劑量組(NM)(予腦蛋白水解物105 mg·kg-1·d-1)、正常+腦蛋白低劑量組(NL)(予腦蛋白水解物52.5 mg·kg-1·d-1)；模型組(M)(予蒸餾水0.2 ml/d)、模型+陽性藥組(MP)(予吡拉西坦540 mg·kg-1·d-1)、模型+腦蛋白高劑量組(MH)(予腦蛋白水解物210 mg·kg-1·d-1)、模型+腦蛋白中劑量組(MM)(予腦蛋白水解物105 mg·kg-1·d-1)、模型+腦蛋白低劑量組(ML)(予腦蛋白水解物52.5 mg·kg-1·d-1)。每組14只，分籠飼養(yǎng)，各組小鼠連續(xù)灌胃給藥35 d，給藥期間自由攝食和飲水，保持正常晝夜循環(huán)。

1.5跳臺實(shí)驗(yàn)〔9〕實(shí)驗(yàn)共2 d，第1天為學(xué)習(xí)階段，第2天為測試階段。學(xué)習(xí)階段將小鼠放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3 min，通32 V交流電，記錄5 min內(nèi)跳下平臺的錯誤次數(shù)作為學(xué)習(xí)成績。除正常組外，模型組小鼠立即腹腔注射亞硝酸鈉溶液120 mg/kg。24 h后進(jìn)行重復(fù)跳臺實(shí)驗(yàn)，記錄潛伏期和錯誤次數(shù)，作為小鼠測試成績。

1.6生化指標(biāo)檢測

1.6.1血清指標(biāo)檢測小鼠眼球取血，置于4℃離心機(jī)中5 000 r/min離心10 min，取血清，-20℃儲存，備用。小鼠血清MDA含量和SOD活性檢測步驟參照試劑盒說明書，采用紫外可見分光光度計進(jìn)行檢測。

1.6.2腦組織指標(biāo)檢測稱取小鼠全腦組織，置于勻漿器中，加入9倍體積的生理鹽水，在冰水浴中用手提式勻漿器研磨充分，4℃ 3 500 r/min離心10 min，取上清液，-20℃儲存，采用BCA蛋白檢測試劑盒測定小鼠腦組織蛋白含量。檢測步驟參照試劑盒說明書。

1.7小鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)檢測(HE染色)將腦組織用乙醇、二甲苯脫水后，按常規(guī)方法用石蠟包埋，制成蠟塊。蠟塊經(jīng)切片機(jī)切成5 μm的薄片，撈片，置于60℃烘箱中15 min烘干。將石蠟切片經(jīng)二甲苯、乙醇脫蠟后自來水沖洗5 min，再用蒸餾水浸濕；在蘇木素中染色2~3 min，自來水沖洗；放入鹽酸酒精中分色5 min，自來水沖洗10 min；放入伊紅中染色2 min，自來水沖洗；切片乙醇、二甲苯脫水后，中性樹膠封片。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS16.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1腦蛋白水解物對小鼠學(xué)習(xí)記憶鞏固能力的影響與NC組比較，NH、NM和NL組第1天錯誤次數(shù)無顯著性差異，NH和NM組第2天潛伏期明顯延長(P<0.05)，錯誤次數(shù)明顯減少(P<0.05)；NL組第2天潛伏期有延長的趨勢，錯誤次數(shù)有增加的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義，與NC組小鼠比較，M、MH、MM、ML和MP組小鼠第1天錯誤次數(shù)均無顯著性差異；與M組小鼠比較，MH和MM組小鼠第2天潛伏期明顯延長(P<0.05)，錯誤次數(shù)明顯減少(P<0.05)；ML組小鼠無顯著性差異，見表1。

組別第1天錯誤次數(shù)第2天潛伏期(s)第2天錯誤次數(shù)NC組4.79±2.7840.57±27.633.86±1.29NP組3.93±2.0983.64±75.012.64±1.98NH組4.57±2.44131.64±89.031)2.71±2.021)NM組4.64±2.31149.36±101.171)1.43±1.091)NL組5.07±1.3897.36±87.633.29±1.98M7.43±2.7717.43±10.878.36±2.84MP4.79±2.331)16.21±9.568.36±2.79MH5.29±3.2057.71±110.011)5.14±3.821)MM4.36±1.8636.14±20.462)4.00±2.151)ML6.71±5.3410.43±12.469.79±7.59

與NC組比較：1)P<0.05；與M組比較：2)P<0.05；下表同

2.2腦蛋白水解物對小鼠血清SOD活性和MDA含量的影響與NC組小鼠比較，NH組小鼠血清中SOD活性升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義；NM和NL組小鼠血清中SOD活性明顯升高(P<0.05)，M、MH、MM、ML和MP組小鼠血清中SOD活性均明顯升高(P<0.05)；各組MDA含量無明顯變化，見表2。

與NC組小鼠比較，NH、NM和NL組小鼠腦組織中SOD活力均有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義；MDA含量均無明顯變化，見表2。

組別SOD(U/mgprot)MDA(μmol/mgprot)NC100.81±15.975.35±1.10NP122.16±10.451)5.17±1.30NH113.81±19.045.33±0.96NM124.13±16.361)5.04±1.18NL121.34±16.131)5.55±1.12M170.83±10.821)3.24±2.18MP171.75±3.371)10.97±23.06MH163.57±10.351)6.03±6.12MM165.54±11.421)2.91±1.40ML161.99±11.651)14.46±10.93

2.3腦蛋白水解物對小鼠腦組織中GABA、Na+-K+-ATP、MDA、AChE含量及SOD活性的影響與NC組小鼠比較，M組小鼠腦組織中Na+-K+-ATP、GABA含量和SOD活性均有明顯降低(P<0.05)，MDA、AChE含量均明顯升高(P<0.05)；MH組小鼠腦組織中AChE含量和SOD活性均明顯降低(P<0.05)，MDA含量明顯升高(P<0.05)，Na+-K+-ATP含量有降低的趨勢、GABA含量有升高的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義；MM組小鼠腦組織中Na+-K+-ATP、AChE含量明顯降低(P<0.05)，MDA含量明顯升高(P<0.05)，GABA含量有升高趨勢，SOD活性有降低趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義；ML組小鼠腦組織中Na+-K+-ATP、AChE含量明顯降低(P<0.05)，MDA含量明顯升高(P<0.05)，GABA含量有升高趨勢，SOD活性有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義；與M組小鼠比較，MH、MM和ML組小鼠腦組織中Na+-K+-ATP、GABA含量均明顯升高(P<0.05)，AChE含量明顯降低(P<0.05)；MH、MM和ML組小鼠腦組織中MDA含量均有降低的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義；MH組小鼠腦組織中SOD活性有降低的趨勢，MM和ML組小鼠腦組織中SOD活性有升高的趨勢，但均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3，表4。

組別GABA(ng/ml)Na+-K+-ATP(μmolpi/mgprot)SOD(U/mgprot)MDA(μmol/mgprot)AChE(U/mgprot)NC1.51±0.091.72±0.09119.72±16.377.84±1.001.37±0.10NP1.57±0.171.57±0.14116.97±12.738.25±0.951.43±0.12NH1.85±0.101)1.72±0.15105.86±27.847.64±1.211.16±0.191)NM1.78±0.121)1.63±0.18116.15±26.468.43±1.741.25±0.10NL1.84±0.091)1.56±0.35102.98±33.038.95±1.201.26±0.08

組別Na+-K+-ATP(μmolpi/mgprot)MDA(μmol/mgprot)GABA(ng/ml)AChE(U/mgprot)SOD(U/mgprot)M1.17±0.171)11.50±1.571)1.27±0.161)1.51±0.101)60.14±38.471)MP1.25±0.151)8.91±1.382)1.25±0.041)1.03±0.181)84.12±54.93MH1.55±0.152)10.62±1.601)1.64±0.152)1.13±0.081)2)22.92±14.461)MM1.51±0.151)2)10.97±1.161)1.62±0.202)1.15±0.081)2)89.46±33.22ML1.51±0.371)2)11.01±1.871)1.63±0.162)1.16±0.091)2)87.27±44.87

2.3小鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)(HE染色)NC組小鼠腦組織海馬區(qū)細(xì)胞總體染色較淺，細(xì)胞層次和界限清楚，排列整齊，染色質(zhì)均勻，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整。NP組小鼠腦組織海馬區(qū)椎體細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞未出現(xiàn)空泡變性，未見細(xì)胞壞死；NH組小鼠腦組織海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞未出現(xiàn)空泡變性，未見細(xì)胞壞死；NM組小鼠腦組織海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列尚整齊，鮮見細(xì)胞空泡變性及壞死；NL組小鼠腦組織海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列比較整齊，少量細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性及壞死。

M組小鼠腦組織海馬區(qū)染色較深，細(xì)胞胞體邊界因染色深而更加清晰，神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞排列較正常對照組散亂，游離細(xì)胞增加，結(jié)構(gòu)模糊或消失，部分細(xì)胞有空泡變性，膠質(zhì)細(xì)胞增生；MP組小鼠腦組織海馬區(qū)較正常陽性藥組小鼠腦組織海馬區(qū)椎體細(xì)胞排列紊亂，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性；MH組小鼠腦組織海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列較正常高劑量組小鼠紊亂，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性及壞死；MM組小鼠腦組織海馬區(qū)錐體細(xì)胞較正常中劑量組小鼠排列紊亂，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性及壞死；ML組小鼠腦組織海馬區(qū)錐體細(xì)胞較正常低劑量組小鼠排列紊亂，顏色變深，細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性及壞死。見圖1。

圖1　各組小鼠腦組織病理學(xué)形態(tài)變化

3討論

記憶障礙模型是評價藥物對記憶過程影響的有效手段。亞硝酸鈉是一種致缺氧劑，大量亞硝酸鹽進(jìn)入機(jī)體，可使正常的血紅蛋白變?yōu)楦哞F血紅蛋白，失去攜氧能力，引起組織缺氧，進(jìn)而引起腦內(nèi)GABA、多巴胺及氨基酸類等神經(jīng)遞質(zhì)濃度失衡，腦內(nèi)乙酰膽堿的合成和釋放降低，神經(jīng)元可塑性改變及神經(jīng)細(xì)胞壞死，引起動物記憶鞏固障礙〔10〕。

乙酰膽堿是參與腦內(nèi)多種與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)活動的重要神經(jīng)遞質(zhì)，其腦內(nèi)含量是衡量機(jī)體學(xué)習(xí)記憶能力的重要指標(biāo)之一，所以，作為能水解乙酰膽堿的AChE也是衡量機(jī)體膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)活性的指標(biāo)〔11，12〕。本研究中，腦蛋白水解物在小鼠體內(nèi)可以減少AChE的生成，通過減少水解乙酰膽堿來提高機(jī)體膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的活性。

Na+-K+-ATP酶主要分布在細(xì)胞膜上，是維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)功能和細(xì)胞膜內(nèi)外離子平衡的重要保障。有研究結(jié)果顯示，腦內(nèi)的離子流紊亂導(dǎo)致腦內(nèi)供氧缺乏、細(xì)胞衰老、腦組織損傷、學(xué)習(xí)記憶障礙的重要原因〔13〕。本實(shí)驗(yàn)中，腦蛋白水解物在小鼠體內(nèi)可調(diào)節(jié)Na+-K+-ATP酶含量，維持離子平衡，改善腦供氧不足。SOD和GABA是體內(nèi)抗氧化的重要組成成分，能清除體內(nèi)的活性氧自由基、過氧化氫和脂質(zhì)過氧化物，保護(hù)細(xì)胞膜免受自由基的過氧化損傷。因此，測定主要過氧化反應(yīng)代謝產(chǎn)物的MDA和過氧化防御體系中重要的SOD和GABA的含量均可以反映機(jī)體的自由基代謝水平。本實(shí)驗(yàn)中，腦蛋白水解物可明顯提高正常小鼠SOD活力，減少M(fèi)DA的生成，具有明顯的抗氧化能力。表明腦蛋白水解物可通過抗氧化，抑制AChE等途徑改善學(xué)習(xí)記憶能力，為臨床治療相關(guān)疾病提供科學(xué)依據(jù)。

海馬區(qū)、大腦皮層的顳葉下部、丘腦和邊緣系統(tǒng)等都與學(xué)習(xí)和記憶功能相關(guān)，其中，海馬區(qū)和大腦皮層尤其重要。本文病理學(xué)結(jié)果表明，腦蛋白水解物對小鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞有修復(fù)作用，間接提高了小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

本實(shí)驗(yàn)從行為學(xué)和分子水平兩個方面研究腦蛋白水解物對正常小鼠和記憶鞏固障礙模型小鼠的影響。結(jié)果可知，腦蛋白水解物能延長小鼠潛伏期，減少錯誤次數(shù)；降低小鼠血清MDA含量，升高血清SOD活性；降低小鼠腦組織中Na+-K+-ATP和AChE含量，升高GABA含量，表明腦蛋白水解物對正常小鼠腦組織及形態(tài)學(xué)無明顯影響，對記記憶鞏固障礙模型小鼠腦組織有不同程度的修復(fù)作用。但學(xué)習(xí)記憶能力是記憶獲得、記憶鞏固和記憶再現(xiàn)的綜合過程，腦蛋白水解物增強(qiáng)和改善學(xué)習(xí)記憶力的作用是否與其他過程有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

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〔2014-05-17修回〕

(編輯李相軍)