吳藝飛，丁茁荑，戴雄澤，周曉波，汪端華

（湖南省蔬菜研究所/湖南省蔬菜工程技術(shù)研究中心，長沙410125）

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紅菜薹小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究

吳藝飛，丁茁荑*，戴雄澤，周曉波，汪端華

（湖南省蔬菜研究所/湖南省蔬菜工程技術(shù)研究中心，長沙410125）

摘 要：以5個(gè)紅菜薹品種為試材，從花蕾的選擇、影響小孢子出胚的關(guān)鍵因素、胚狀體成苗及生根條件等方面對紅菜薹小孢子培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果表明：小孢子培養(yǎng)取樣最佳時(shí)期為單核靠邊期，瓣萼比在0. 626～0. 834之間；基因型不同對小孢子培養(yǎng)影響很大，以H13 -3出胚率最高，為2. 78個(gè)/皿；胚狀體誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為Keller-13添加6-BA 1. 0 mg/ L + KT1. 0 mg/ L + NAA0. 5 mg/ L，出胚率為2. 67個(gè)/皿，且70%以上為子葉形胚；轉(zhuǎn)接胚狀體最適宜的胚齡為15～25 d，成苗率在65%～83%；再生植株生根培養(yǎng)基添加NAA最適濃度為0. 4 mg/ L，側(cè)根多而粗壯，移栽成活率高。

關(guān)鍵詞：紅菜薹；小孢子培養(yǎng)；胚狀體；出胚率

人們早已認(rèn)識到植物單倍體育種在遺傳育種上的重大意義。利用小孢子培養(yǎng)選育出新品種并推廣的作物有油菜、大白菜等。游離小孢子培養(yǎng)是將花藥中分離出來的游離小孢子進(jìn)行胚誘導(dǎo)培養(yǎng)，其誘導(dǎo)頻率比花藥培養(yǎng)要高。由它直接發(fā)育得來的再生植株是純合體，能大大縮短親本純合的時(shí)間，加快育種進(jìn)程，還可以得到部分由隱性基因所控制的遺傳性狀，為選育新品種開辟新途徑［1，2］。因此對游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行全面研究意義非常重大。

與蕓薹屬許多其他作物如甘藍(lán)型油菜、大白菜等相比較而言，紅菜薹（Brassiea campestris L. ssp Chinensis L var. Utilis Tsenet Lee.）小孢子培養(yǎng)研究起步比較晚，技術(shù)不很成熟。近幾年隨著各地對紅菜薹育種的深入研究，小孢子培養(yǎng)技術(shù)取得了很大的進(jìn)展，在育種上的應(yīng)用前景越來越大［3］。為使小孢子培養(yǎng)方法能成功運(yùn)用于紅菜薹育種實(shí)踐中，本研究對影響紅菜薹小孢子培養(yǎng)的關(guān)鍵因素進(jìn)行了分析，并對胚狀體成苗及生根條件進(jìn)行篩選，以為大規(guī)模開展紅菜薹小孢子培養(yǎng)提供參考。

1 材料與方法

1. 1 材料

試驗(yàn)材料為前期試驗(yàn)中出胚率較高的H13 -1、H13 -2、H13 -3、H13 -4和H13 -5，所有種子均由湖南省蔬菜研究所菜薹課題組提供。本試驗(yàn)在湖南省蔬菜研究所完成。于2014年11月上旬播種于大棚苗床中，12月底定植于大棚內(nèi)，加強(qiáng)肥水管理，2015年2月進(jìn)入始花期。

1. 2 方法

（1）花蕾的選擇及臨時(shí)裝片的制作。從初花期開始，晴天上午9：00前采集花蕾帶回實(shí)驗(yàn)室備用。用游標(biāo)卡尺測量花蕾的縱徑長、橫徑長、花萼長、花瓣長并記錄其形態(tài)特征。將花藥放在載玻片上，加一滴醋酸洋紅染色劑，用小刀輕壓花藥擠出花粉，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察小孢子發(fā)育時(shí)期。每組觀察5個(gè)花蕾。

（2）不同激素種類和濃度對小孢子胚狀體誘導(dǎo)的影響。以H13 - 3為試材，小孢子培養(yǎng)基本培養(yǎng)基為keller-13（Keller + 13%蔗糖，下同）液體培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA（0、1. 0、2. 0 mg/ L）、KT （0、1. 0、2. 0 mg/ L）和NAA 0. 5 mg/ L。采用兩因素多水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每處理接種10皿，3次重復(fù)。接種后20 d統(tǒng)計(jì)出胚情況。

（3）不同基因型對小孢子胚狀體誘導(dǎo)的差異。以H13 -1、H13 -2、H13 -3、H13 -4和H13 -5等5個(gè)不同基因型為試材，以不加瓊脂的Keller-13為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加1. 0 mg/ L 6-BA +0. 5 mg/ L 2，4-D + 0. 2 mg/ L NAA +0. 2 g/ L活性炭。每個(gè)品種接種10皿，設(shè)3次重復(fù)，接種20 d后統(tǒng)計(jì)出胚情況。

（4）不同胚齡胚狀體對成苗的影響。將不同胚齡的胚狀體（10、15、20、25、30 d）轉(zhuǎn)接至MS + 0. 5 mg/ L 6-BA +0. 1 mg/ L NAA +0. 2 g/ L活性炭+ 30 g/ L蔗糖+10 g/ L瓊脂的培養(yǎng)基中。每處理接種10個(gè)胚狀體，重復(fù)3次，接種25～30 d后統(tǒng)計(jì)成苗情況。

（5）不同NAA濃度對幼苗生根的影響。以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將成苗后的幼苗轉(zhuǎn)至添加不同濃度NAA（0、0. 2、0. 4、0. 6 mg/ L）的培養(yǎng)基中。每處理接種10株，3次重復(fù)，20～25 d后統(tǒng)計(jì)生根情況。

2 結(jié)果與分析

2. 1 紅菜薹小孢子各發(fā)育階段的細(xì)胞學(xué)特征比較

通過對紅菜薹花粉粒發(fā)育時(shí)期的顯微觀察中，發(fā)現(xiàn)同一個(gè)花藥中包含著幾個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的小孢子，各發(fā)育時(shí)期的小孢子所占的比例會(huì)隨著花蕾的發(fā)育發(fā)生相應(yīng)的變化。通過顯微觀察將占總比例最多的發(fā)育時(shí)期作為其對應(yīng)的花藥所處的發(fā)育時(shí)期，可將其分為4個(gè)時(shí)期：小孢子母細(xì)胞時(shí)期、二分體和四分體時(shí)期、小孢子時(shí)期（單核早中期、單核靠邊期和雙核期）和成熟花粉粒時(shí)期［4］（圖1）。

圖1 小孢子發(fā)育時(shí)期細(xì)胞顯微觀察

2. 2 小孢子各發(fā)育時(shí)期與花蕾大小、瓣萼比的相關(guān)性

從表1可知，紅菜薹小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾的外部形態(tài)特征密切相關(guān)。同一紅菜薹品種小孢子發(fā)育不同時(shí)期的花蕾縱徑、橫徑、花萼長度、花瓣長度以及瓣萼比都存在顯著差異。隨著小孢子的發(fā)育，花蕾縱徑、橫徑、花萼長度、花瓣長度及瓣萼比均出現(xiàn)增長趨勢，且增長的幅度越來越大；不同品種處于同一小孢子發(fā)育時(shí)期花蕾大小、花瓣、花萼長度以及瓣萼比也存在顯著差異。不同品種的紅菜薹處于單核靠邊期時(shí)，花蕾的大小、花瓣和花萼的長度以及瓣萼比均存在差異?；ɡ俚目v徑在2. 890～3. 394 mm之間，橫徑在1. 910～2. 180 mm之間，花萼長度在2. 764～3. 316 mm之間，花瓣長度在1. 926～2. 357 mm之間，瓣萼比在0. 657～0. 834之間。

表1 不同紅菜薹品種小孢子各發(fā)育時(shí)期花蕾的形態(tài)特征

2. 3 不同激素種類和濃度配比對小孢子胚狀體誘導(dǎo)的影響

從表2可以看出，添加不同激素種類和濃度的高低對紅菜薹小孢子胚誘導(dǎo)影響很大，各處理差異顯著。在一定程度下，添加6-BA、KT和NAA均能提高小孢子胚狀體誘導(dǎo)頻率，3種激素的誘導(dǎo)效果為：6-BA > KT > NAA，同時(shí)添加3種激素比單獨(dú)添加1種激素的誘導(dǎo)效果更佳。3種激素的最佳配比為：6-BA 1. 0 + KT 1. 0 + NAA 0. 5，此時(shí)小孢子胚狀體出胚率最高，為2. 67個(gè)/皿，且70%以上為子葉形胚，占比最高，更易成苗。

表2 不同激素種類和濃度配比的小孢子胚狀體誘導(dǎo)結(jié)果

（續(xù)表2）

2. 4 不同基因型對小孢子胚狀體誘導(dǎo)的差異

由表3可知，基因型不同對紅菜薹小孢子出胚影響極大，不同基因型間差異顯著。在供試的5個(gè)品種中，以H13 -3出胚率最高，為2. 78個(gè)/皿，H13 -2次之，為2. 21個(gè)/皿，H13 - 4胚狀體誘導(dǎo)頻率最低，只有0. 41個(gè)/皿。

表3 不同基因型的小孢子胚狀體誘導(dǎo)結(jié)果比較

2. 5 不同胚齡胚狀體對成苗的影響

從表4可以看到，胚齡的長短直接影響胚狀體的成苗。紅菜薹小孢子培養(yǎng)胚狀體最適宜的胚齡為15～25 d，成苗率在65%～83%，胚狀體轉(zhuǎn)接后很快轉(zhuǎn)綠分化出苗。超過25 d或低于15 d，成苗率均呈下降趨勢。胚齡過短，接種后胚狀體生長緩慢，易黃化而死，成苗率低；胚齡過長，胚狀體老化，分化效率下降，易褐化而死。

表4 不同胚齡胚狀體的成苗結(jié)果

2. 6 NAA濃度對幼苗生根的影響

由表5可知，NAA濃度的高低與再生植株生根密切相關(guān)，各處理間生根效果差異顯著。不添加NAA也能部分生根，但根系很細(xì)弱，側(cè)根少；添加NAA后，根量大大增加，側(cè)根多而粗壯，移栽易于成活。但添加NAA也不宜過量，如添加過多根量太多而壯，反而影響植株的生長，且根系變脆易斷，不利于移栽成活。添加NAA最適濃度為0. 4 mg/ L，有3 ～4條較粗壯的側(cè)根，移栽成活率可達(dá)90%以上。

表5 不同NAA添加濃度處理的幼苗生根效果比較

3 討論與結(jié)論

3. 1 關(guān)于影響小孢子培養(yǎng)出胚率的因素

紅菜薹小孢子發(fā)育時(shí)期與花蕾外觀形態(tài)密切相關(guān)，同一品種小孢子不同發(fā)育時(shí)期的花蕾外觀之間存在差異；不同品種的菜薹小孢子處于同一時(shí)期時(shí)花蕾外觀形態(tài)特征也存在差異。通過試驗(yàn)找到一些關(guān)于取材的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)：花蕾表面無損傷，花萼包裹著花冠，花蕾未開裂，當(dāng)花瓣為花藥的1/2～4/5（比值最大不能超過1）時(shí)小孢子正處于單核靠邊期，為接種的最佳時(shí)期。由于小孢子單核靠邊期是有絲分裂的觸點(diǎn)，當(dāng)條件出現(xiàn)異常時(shí)，有絲分裂很容易被中止，發(fā)育進(jìn)程被改變，小孢子將從配子體發(fā)育階段轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育階段，分裂形成愈傷組織或胚狀體，最終發(fā)育為單倍體植株。取單核靠邊期的花蕾接種，此時(shí)小孢子剛好處于第1次有絲分裂階段且細(xì)胞中營養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)備最充足，有利于促進(jìn)小孢子的啟動(dòng)和分化，提高小孢子胚和愈傷組織的產(chǎn)生。

基因型的差異是影響小孢子培養(yǎng)出胚率的關(guān)鍵因素，不同基因型出胚率差異很大，這一現(xiàn)象在很多植物小孢子培養(yǎng)過程中普遍存在，關(guān)于這一現(xiàn)象的作用機(jī)理還在研究當(dāng)中。本試驗(yàn)供試的5個(gè)基因型紅菜薹出胚率差異非常顯著。筆者多年試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將出胚率低的品種與出胚率高的品種雜交后，F(xiàn)1出胚率會(huì)大大提高，這說明影響出胚的基因是由多對基因控制的，且這種基因是可遺傳的。

適當(dāng)添加部分激素對小孢子胚誘導(dǎo)可起到促進(jìn)作用。本研究添加了6-BA、KT、NAA3種激素，均在一定程度上提高了胚狀體誘導(dǎo)率，6-BA對胚狀體誘導(dǎo)效果最佳，KT次之。最佳的胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為6-BA 1. 0 mg/ L + KT 1. 0 mg/ L + NAA 0. 5 mg/ L。這一結(jié)果與本研究前期試驗(yàn)結(jié)果一致［5］，但與張秀武等［6］的研究結(jié)果不一致，其原因有待進(jìn)一步研究。

3. 2 關(guān)于胚狀體植株再生

胚狀體直接成苗率一直較低，胚齡的長短對胚狀體成苗影響很大，胚齡過長和過短均不利于成苗。胚齡過短，胚狀體容易出現(xiàn)玻璃化或黃化，生長不良而死；胚齡過長，胚狀體分化能力減弱，易褐化導(dǎo)致成苗率下降。本研究結(jié)果表明，將胚齡為15～25 d，轉(zhuǎn)接至MS +0. 5 mg/ L 6-BA +0. 1 mg/ L NAA +0. 2 g/ L活性炭+ 30 g/ L蔗糖+ 10 g/ L瓊脂的培養(yǎng)基中，胚狀體成苗率可達(dá)65%～83%。

通過添加適量的NAA可以促進(jìn)胚狀體再生植株生根，提高移栽成活率。本研究通過添加0. 4 mg/ L NAA后，可使生根率達(dá)100%，發(fā)出的側(cè)根多而粗壯，從而大大提高再生植株移栽成活率。

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Study on Microspore Culture Techniques in Purple Flowering Stalk（Brassica campestris）

WU Yifei，DING Zuoyi*，DAI Xiongze，ZHOU Xiaobo，WANG Duanhua

（Hunan Vegetable Research Institute/ Hunan Vegetable Research and Development Center，Changsha，Hunan 410125，China）

Abstract：With five purple flowering stalk varieties as test materials，the microspore culture techniques in purple flowering stalk were systematically studied from some aspects，such as choice of buds，key factors affecting on microspore embryogenesis，seedling formation of embryoid and rooting conditions，and so on. The results showed that the optimum sampling period of microspore culture was the late uninucleate stage and 0. 626～0. 834 sepal than. Genotype had great influence on microspore culture，and embryogenesis rate of H13 -3 was highest，2. 78/ dish. The optimum culture medium embryoid for induction was Keller-13 with 6-BA 1. 0 mg/ L + KT 1. 0 mg/ L + NAA 0. 5 mg/ L，and the embryogenesis ratewas 2. 67/ dish，and more than 70% was cotyledon embryo. The optimum embryonic age to transfer embryoid was 15～25 d，and the seedling rate could reach to 65%～83%. The regeneration optimal concentration of NAA added into rooting medium was 0. 4 mg/ L，which could gain more thick lateral root and higher transplanting survival rate.

Keywords：purple flowering stalk；microspore culture；embryoid；embryogenesis rate

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（CARS -25）。

作者簡介：吳藝飛（1982 -），女，從事十字花科蔬菜遺傳育種工作，Email：406522996@ qq. com。*通信作者：丁茁荑，研究員，從事十字花科蔬菜遺傳育種工作，Email：dingzhuoyi@163. com。

收稿日期：2015 10 16

文章編號：1001-5280（2016）01-0073-05

DOI：10. 16848/ j. cnki. issn. 1001-5280. 2016. 01. 019

中圖分類號：S634. 6

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A