趙艷艷 牛劉靜 原玉香 魏小春 楊雙娟 王志勇 張曉偉 張衍榮

摘? ? 要：為了優(yōu)化菜心小孢子培養(yǎng)體系，以10個(gè)菜心品種為試材進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，研究基因型、不同培養(yǎng)基配方和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)小孢子胚誘導(dǎo)率的影響。結(jié)果表明，基因型是決定菜心品種能否出胚的一個(gè)重要因素，且不同基因型試材間小孢子胚誘導(dǎo)率具有明顯差異，其中‘Cx1‘Cx6‘Cx8經(jīng)過(guò)小孢子培養(yǎng)后較易獲得胚狀體，而其他材料則沒(méi)有獲得胚狀體，基因型的不同導(dǎo)致胚狀體誘導(dǎo)率在0～2.10胚·蕾-1之間;同一基因型，在不同培養(yǎng)基成分誘導(dǎo)條件下，添加活性炭對(duì)小孢子胚狀體誘導(dǎo)率的影響較大，胚誘導(dǎo)率在0.03～2.10胚·蕾-1之間;培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量濃度為130 g·L-1時(shí)，‘Cx1的胚誘導(dǎo)率最高;此外，在培養(yǎng)基中添加0.05 mg·L-1 6-BA和0.5 mg·L-1 NAA可以顯著提高菜心‘Cx1胚狀體誘導(dǎo)率。

關(guān)鍵詞：菜心;小孢子培養(yǎng);胚狀體

中圖分類號(hào)：S634.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2020）07-034-05

Abstract：In order to optimize microspore culture system of flowering Chinese cabbage， 10 cultivars of Brassica campestris L. ssp. chinensis L. var. utilis Tsen et Lee were used for microspore culture. The effects of genotypes， different culture medium and plant growth regulator on microspore embryogenesis were studied. The results showed that genotype were one of the greatest effects on embryos induction rate， the induction frequencies of embryo were extremely different in the same culture condition， ‘Cx1，‘Cx6，‘Cx8was easier to obtain embryos， but the other materials did not obtain embryos. The induction rate of embryos was between 0-2.10 embryoid each bud due to the difference of genotypes. Same genotype under the condition of different medium components， especially the addition of activated carbon had the greatest effect on the induction rate of embryos， between 0.03-2.10 embryoid each bud. When sucrose concentration was 130 g·L-1 in the culture medium， the embryo induction rate of microspore culture was the highest. Furthermore， the rate of embryos induction of ‘Cx1was significantly increased by adding 0.05 mg·L-1 6-BA and 0.5 mg·L-1 NAA to the medium.

Key words： Flowering Chinese cabbage; Microspore culture; Embryoid

菜心（Brassica campestris L. ssp. chinensis L. var. utilis Tsen et Lee）又稱菜薹，在廣東省分布廣、栽培面積大、復(fù)種指數(shù)也比較高，近幾年在河南、寧夏、廣西、福建、海南等地也有大面積的種植。菜心是河南省供港蔬菜基地出口的重要蔬菜種類之一，在西華、安陽(yáng)、滎陽(yáng)、許昌等地都有大規(guī)模種植，帶動(dòng)了周邊農(nóng)民增收致富[1]。但是菜心種質(zhì)資源匱乏，適宜多地種植的優(yōu)良菜心品種不多，因此選育優(yōu)質(zhì)、抗病、抗逆、整齊度高的菜心雜種一代新品種（組合）具有重大的生產(chǎn)推廣價(jià)值和龐大的消費(fèi)市場(chǎng)。

目前生產(chǎn)應(yīng)用上主要以系統(tǒng)選育育成的常規(guī)品種為主[2-3]，而現(xiàn)代生物育種技術(shù)——小孢子培養(yǎng)技術(shù)目前已經(jīng)在十字花科蕓薹屬多種蔬菜作物上有了應(yīng)用[4-8]，并且利用所獲得的小孢子再生植株（DH系）快速高效地培育出了多個(gè)新品種[9-11]。在菜心利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究上，朱允華等[12]和曾小玲等[13]發(fā)表了一些有關(guān)報(bào)道，但由于菜心出胚困難及出胚少的緣故，試驗(yàn)獲得的正常胚狀體和再生植株數(shù)量有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足菜心育種工作中所需要的純系植株。因此，在此基礎(chǔ)上完善菜心游離小孢子培養(yǎng)體系，培育菜心不同類型的優(yōu)良DH系對(duì)接下來(lái)進(jìn)一步選育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、整齊一致的菜心新品種或新種類至關(guān)重要，不僅是解決菜心自交退化的關(guān)鍵，與此同時(shí)也可解決雄性不育系選育工作中遇到的一些困難。故在前人大量的研究報(bào)道和育種成果基礎(chǔ)上，筆者以收集的10種不同基因型菜心種質(zhì)資源為試材，從基因型、蔗糖、活性炭和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等4方面來(lái)探討，以期優(yōu)化菜心小孢子培養(yǎng)體系，創(chuàng)制出多樣性的菜心DH系，選出育種可利用的優(yōu)異DH系，配制雜交組合，應(yīng)用到菜心雜種優(yōu)勢(shì)育種實(shí)踐中。

1 材料和方法

1.1 材料

供試驗(yàn)使用的10份材料編號(hào)為‘Cx1‘Cx2‘Cx3‘Cx4‘Cx5‘Cx6‘Cx7‘Cx8‘Cx9‘Cx10，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所葉類蔬菜研究室、廣州金穗種業(yè)有限公司提供。2019年8月上中旬播種于河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開(kāi)發(fā)基地，2019年10月初植株開(kāi)花后取材進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，該試驗(yàn)在河南省農(nóng)科院園藝研究所完成。

1.2 方法

1.2.1 游離小孢子培養(yǎng)方法 選取無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)裂蕾的花序，根據(jù)試驗(yàn)需求選取適量的材料放置試驗(yàn)袋中，噴水后放至4 ℃冰箱里低溫預(yù)處理24 h，當(dāng)花蕾長(zhǎng)度在2.1～2.5 mm之間時(shí)，進(jìn)行小孢子培養(yǎng)。提取小孢子應(yīng)選取花蕾的標(biāo)準(zhǔn)為：剝開(kāi)花蕾后花瓣應(yīng)位于花藥1/2～2/3的位置處。將挑選好的花蕾用75%的酒精和1%的次氯酸鈉溶液分別消毒30 s和15 min，最后用經(jīng)過(guò)高壓滅菌的超純水清洗3遍，每次5 min。

Keller液體培養(yǎng)基作為洗液。第一步：將消過(guò)毒的花蕾夾到研磨管底部，加入2～3 mL沖洗液，研磨使花蕾中的小孢子分離出來(lái);第二步：將研磨好的溶液倒入過(guò)濾網(wǎng)漏斗中過(guò)濾，確保將研磨的濾液完全滴入有刻度的離心管中，加入沖洗液定容至10 mL，蓋上離心管蓋并且用封口膜封緊管口防止溶液溢出，離心機(jī)中800 r·min-1離心3 min，倒出上層清液，只留下底部小孢子懸浮液;第三步：分別加入培養(yǎng)液至8 mL、6 mL并重復(fù)上述步驟。將以上步驟獲得的小孢子溶液加入NLN培養(yǎng)液至一定的刻度并攪拌均勻，分別加入2 mL到已加入適量培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中;使用封口膜將培養(yǎng)皿封嚴(yán)封緊不留空隙，培養(yǎng)皿放置在32～33 ℃的光照培養(yǎng)箱中處理24 h后，25 ℃暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)期間定期觀察培養(yǎng)皿中小孢子生長(zhǎng)情況，至20 d左右統(tǒng)計(jì)并記錄出胚數(shù)目。

1.2.2 配制培養(yǎng)基 Keller液體培養(yǎng)基作為洗液。采用PhytotechbNLN培養(yǎng)基加入瓊脂，蔗糖和蒸餾水。用蒸餾水定容至所需體積，使用pH酸度計(jì)來(lái)調(diào)節(jié)沖洗液和NLN培養(yǎng)基的pH值均為5.8。沖洗液需要使用高壓鍋進(jìn)行滅菌（121 ℃，20 min），NLN培養(yǎng)液則需要使用過(guò)濾器經(jīng)過(guò)0.22 ?m的微孔濾膜過(guò)濾滅菌至無(wú)菌大三角瓶中，且以每瓶25～30 mL的體積分裝NLN培養(yǎng)液（過(guò)程嚴(yán)格要求無(wú)菌環(huán)境，以免受污染）。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)添加不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、蔗糖、活性炭等，配制6種不同的培養(yǎng)基，分別編號(hào)為N0、N1、N2、N3、N4、N5。

N0：NLN+12%蔗糖+0.5 g·L-1活性炭;N1：NLN+10%蔗糖;N2：NLN+13%蔗糖;N3：NLN+15%蔗糖;N4：NLN+13%蔗糖+0.5 g·L-1活性炭;N5：NLN+13%蔗糖+0.5 g·L-1活性炭+0.05 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA。

1.2.3 影響菜心小孢子出胚率相關(guān)因素的試驗(yàn)設(shè)計(jì) 主要有以下幾項(xiàng)。

（1）菜心不同基因型小孢子出胚情況比較分析：將試材在N0培養(yǎng)基進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，每個(gè)試材取30個(gè)花蕾，分別培養(yǎng)12皿，待20 d后觀察各個(gè)基因型胚狀體誘導(dǎo)情況，分析它們之間出胚率差異。

（2）蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)菜心小孢子胚發(fā)生能力的影響：選取符合試驗(yàn)的基因型材料‘Cx1，對(duì)其進(jìn)行3組處理，第1組用N1培養(yǎng)液處理，其中蔗糖質(zhì)量濃度為100 g·L-1，第2組用N2培養(yǎng)液處理，其中蔗糖質(zhì)量濃度為130 g·L-1，第3組用N3培養(yǎng)液處理，其中蔗糖質(zhì)量濃度為150 g·L-1，每組處理12皿，記錄與分析三者之間的出胚數(shù)目和差異。

（3）活性炭對(duì)菜心小孢子胚發(fā)生能力的影響：選取基因型材料‘Cx1進(jìn)行試驗(yàn)，一組用N4培養(yǎng)基，另一組用不添加活性炭的N2培養(yǎng)基，每組處理培養(yǎng)12皿，在相同的操作步驟及生長(zhǎng)壞境等條件下進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)出胚情況。

（4）培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)菜心小孢子胚發(fā)生能力的影響：對(duì)同一菜心材料‘Cx1分別用添加和不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基培養(yǎng)，將其進(jìn)行2組不同處理，一組用添加0.05 mg·L-1 6-BA和0.5 mg·L-1 NAA的N5培養(yǎng)基，另一組用N4培養(yǎng)基，期間隨時(shí)觀察各個(gè)培養(yǎng)皿的胚狀體形成情況，統(tǒng)計(jì)出胚數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 16.0軟件處理數(shù)據(jù)，單因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，Duncans新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型與出胚率的的關(guān)系

選取10種不同基因型的菜心品種，用N0培養(yǎng)基培養(yǎng)，出胚情況如表1。

由表1可以看出，試驗(yàn)對(duì)比的 10種不同基因型菜心的小孢子在相同的培養(yǎng)基、操作步驟及生長(zhǎng)壞境等條件下進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，其中‘Cx1‘Cx6‘Cx8材料獲得了胚狀體，而‘Cx2‘Cx3‘Cx4‘Cx5‘Cx7‘Cx9‘Cx10材料則沒(méi)有得到胚狀體，其中基因型‘Cx1獲得的胚狀體數(shù)目最多，出胚率為2.10胚·蕾-1，出胚最少的基因型‘Cx6的出胚率僅為0.10胚·蕾-1，兩者相差20倍。因此可以看出，不同基因型的材料之間小孢子胚狀體出胚率差異較大，而且基因型與小孢子胚誘導(dǎo)發(fā)生能力有著緊密聯(lián)系。

2.2 蔗糖對(duì)菜心小孢子胚發(fā)生能力的影響

由表2可以看出，N2培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量濃度（130 g·L-1）較高于N1培養(yǎng)基中的蔗糖質(zhì)量濃度（100 g·L-1），其出胚率1.93胚·蕾-1也高于N1培養(yǎng)基中的出胚率0.97胚·蕾-1，且前者是后者的1.99倍。當(dāng)培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量濃度增加至150 g·L-1時(shí)，‘Cx1的小孢子出胚率顯著降低，僅為0.07胚·蕾-1，與出胚率最高的相差26倍多。由上可得，對(duì)于同一基因型材料進(jìn)行小孢子培養(yǎng)時(shí)，添加適宜的蔗糖質(zhì)量濃度可顯著提高胚狀體誘導(dǎo)率，而當(dāng)添加濃度過(guò)高時(shí)，其胚胎發(fā)生能力則大大降低，胚狀體誘導(dǎo)率呈明顯下降趨勢(shì)。說(shuō)明蔗糖質(zhì)量濃度的高低在一定程度上會(huì)嚴(yán)重影響菜心游離小孢子培養(yǎng)的胚狀體誘導(dǎo)率。

2.3 活性碳對(duì)菜心小孢子胚發(fā)生能力的影響

由表3可以看出，活性炭對(duì)‘Cx1菜心小孢子的出胚率有一定的影響，以下小孢子材料操作培養(yǎng)條件相同的情況下，培養(yǎng)基中加入活性炭的小孢子出胚率較高，培養(yǎng)基中不加活性炭的小孢子出胚率則較低?！瓹x1添加活性炭之后的出胚率為2.10 胚·蕾-1，而不加炭的出胚率僅為0.20 胚·蕾-1，兩者之間的出胚率相差近10倍。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，對(duì)于同一基因型進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中添加少量的活性炭有助于提高小孢子出胚率，因此對(duì)于其他不易出胚的基因型材料在小孢子培養(yǎng)過(guò)程中可添加適量活性炭來(lái)促進(jìn)誘導(dǎo)胚胎發(fā)生能力。

2.4 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)菜心小孢子胚發(fā)生能力的影響

將基因型材料‘Cx1分別用添加（N5）和不添加（N4）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基培養(yǎng)，由表4可以看出，其他操作條件均相同的情況下使用同一基因型材料，在培養(yǎng)基中添加0.05 mg·L-1 6-BA和0.5 mg·L-1 NAA之后‘Cx1的出胚率為 2.13胚·蕾-1，而不添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)其出胚率為0.27 胚·蕾-1，兩者出胚率相差6.89倍。可知，在‘Cx1菜心小孢子培養(yǎng)過(guò)程中添加6-BA和NAA激素組合可以顯著提高小孢子出胚率，從而使獲得子葉型胚狀體的概率變大。

3 討論與結(jié)論

基因型是制約小孢子發(fā)育的重要因素，同樣對(duì)不同基因型菜心小孢子培養(yǎng)的胚胎發(fā)生能力也有明顯影響。本試驗(yàn)中不同基因型材料之間小孢子胚胎發(fā)生率不盡相同，在10份試材中僅有3份成功獲得了胚狀體，且各個(gè)基因型之間出胚率差異較大，其余7份材料經(jīng)多次試驗(yàn)培養(yǎng)后也未能獲得正常的胚芽，這一試驗(yàn)結(jié)果在紅菜薹[14-15]、大白菜[16]和花椰菜[17]等多個(gè)蕓薹屬蔬菜作物小孢子培養(yǎng)中均有類似報(bào)道。有學(xué)者利用菜心和芥藍(lán)種間雜交提高后代親和性，可擴(kuò)大基因型范圍，提高一些難成胚基因型的出胚能力[18]，而這一方法陳文輝等[19]在甘藍(lán)上已經(jīng)獲得了成功。此外，利用快速加代技術(shù)可不受基因型的限制直接獲得純系[20]，在實(shí)際試驗(yàn)工作中，可將其與小孢子培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合使用，來(lái)減少和克服因基因型差異而導(dǎo)致的小孢子培養(yǎng)試驗(yàn)中不出胚或出胚少的問(wèn)題。

在小孢子培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基中的蔗糖是保證小孢子正常發(fā)育的主要能量來(lái)源，還可調(diào)節(jié)滲透壓，為小孢子胚胎發(fā)育營(yíng)造有利的生長(zhǎng)環(huán)境，在多種蕓薹屬蔬菜作物小孢子培養(yǎng)中已多有研究和討論[21-23]。Zhang wei等[21]報(bào)道在13%和16%的蔗糖質(zhì)量濃度下進(jìn)行小孢子培養(yǎng)均可獲得羽衣甘藍(lán)小孢子胚狀體。曾小玲等[13]試驗(yàn)得出，在菜心小孢子培養(yǎng)第1天時(shí)先使用170 g·L-1高質(zhì)量濃度的蔗糖培養(yǎng)之后再轉(zhuǎn)化成130 g·L-1的蔗糖質(zhì)量濃度進(jìn)行培養(yǎng)，可使其胚誘導(dǎo)頻率顯著提高，尤其對(duì)難出胚的基因型材料而言。在本試驗(yàn)中設(shè)計(jì)了100 g·L-1、130 g·L-1和150 g·L-1的蔗糖質(zhì)量濃度梯度進(jìn)行比較試驗(yàn)，結(jié)果得出材料‘Cx1在130 g·L-1濃度下進(jìn)行小孢子培養(yǎng)時(shí)，獲得胚狀體誘導(dǎo)率最高，達(dá)1.93胚·蕾-1，而蔗糖質(zhì)量濃度過(guò)低或過(guò)高時(shí)，小孢子生長(zhǎng)發(fā)育成為胚狀體的效率都有所下降，尤其蔗糖質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)，其胚胎發(fā)生率呈明顯下降趨勢(shì)。

活性炭在小孢子培養(yǎng)中的重要作用早已被證實(shí)[24-25]，但并非對(duì)所有基因型材料都有促進(jìn)作用。國(guó)外學(xué)者[26]研究了活性炭對(duì)多種不同基因型甘藍(lán)類蔬菜作物小孢子培養(yǎng)的影響，得出在培養(yǎng)基中添加1%的活性炭可顯著提高甘藍(lán)類蔬菜小孢子胚胎發(fā)生率，這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。而劉雪平等[27]研究結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中添加一定濃度的活性炭對(duì)甘藍(lán)型油菜小孢子胚狀體形成并無(wú)明顯促進(jìn)作用。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的添加對(duì)于小孢子生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分裂與生長(zhǎng)途徑具有重要作用。NLN培養(yǎng)基中添加一定量的6-BA和NAA可以使胚狀體誘導(dǎo)率顯著提高，這在紅菜薹[14]、白菜[22]、蕪菁[28]和小菘菜[29]等多種蕓薹屬蔬菜作物中均有相關(guān)報(bào)道，但2種激素的適宜使用濃度和配比在不同蕓薹屬蔬菜或相同作物不同基因型材料中有明顯差異。施柳等[30]試驗(yàn)得出，添加0.3 mg·L-1 6-BA可使大白菜小孢子出胚率顯著提高，而趙大芹等[31]研究表明，在黔白大白菜雜交種小孢子培養(yǎng)過(guò)程中使用0.05 mg·L-1 6-BA和0.10 mg·L-1 NAA濃度組合時(shí)，其胚胎發(fā)生率和成熟胚的比例最高。于文佳等[29]也認(rèn)為，在小菘菜小孢子培養(yǎng)中添加0.05 mg·L-1 6-BA和0.20 mg·L-1 NAA所獲得的出胚率要明顯高于不添加激素的對(duì)照?；谇叭说脑囼?yàn)探究結(jié)果，筆者在菜心小孢子培養(yǎng)基中添加0.05 mg·L-1 6-BA和0.5 mg·L-1NAA可以顯著提高‘Cx1的出胚率，此試驗(yàn)結(jié)果與曾小玲等[13]的研究結(jié)論相似。

除常見(jiàn)的6-BA、NAA和KT等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在小孢子培養(yǎng)中應(yīng)用較多且應(yīng)用效果顯著外，國(guó)內(nèi)外多數(shù)學(xué)者也逐漸把在其他作物上有助于提高胚胎發(fā)生能力和促進(jìn)細(xì)胞分裂生長(zhǎng)的添加劑或激素應(yīng)用到了蔬菜作物小孢子培養(yǎng)試驗(yàn)上，并且在一些試材上已經(jīng)獲得了成功。黃天虹等[32]在不結(jié)球白菜小孢子培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，添加一定濃度的頭孢噻胯可提高部分基因型材料的出胚率;Gao等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在NLN-13培養(yǎng)基中添加0.000 1%的非離子型表面活性劑可使紫菜薹小孢子胚胎發(fā)生率和植株再生率顯著提高，且獲得雙單倍體植株達(dá)60%以上。前人的大量報(bào)道和本研究的試驗(yàn)結(jié)果可為菜心和其他作物進(jìn)行小孢子培養(yǎng)試驗(yàn)提供有力的參考依據(jù)和思路。

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