重組H9N2亞型禽流感病毒的構建及其在A549細胞上適應性研究

賈佳

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 廣西南寧 530021）

重組H9N2亞型禽流感病毒的構建及其在A549細胞上適應性研究

賈佳

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 廣西南寧 530021）

目的： 利用反向遺傳技術構建表達GFP并具有感染性的重組H9N2亞型禽流感病毒，并用高劑量和低劑量MOI病毒感染腫瘤細胞A549，研究其對A549腫瘤細胞的作用。方法： 以A/Chicken/Jiangsu/14（H9N2）禽流感病毒為骨架，在NS1和NEP之間插入外源片段GFP。參考8質粒轉染系統(tǒng)，在293T和MDCK細胞上包裝產生重組H9N2病毒。提取尿囊液RNA，PCR鑒定并測序，檢測其TCID50。按照MOI 0.1和2.0分別將重組病毒感染不同的細胞，通過MTT實驗檢測細胞活性。結果： 應用反向遺傳技術成功獲得了重組病毒，并且發(fā)現(xiàn)病毒可以誘導A549的凋亡。結論：成功構建了表達GFP的重組病毒，并且其可以誘導A549的凋亡。

H9N2禽流感病毒 反向遺傳技術 A549

隨著反向遺傳技術的不斷完善，對流感病毒的改造和利用成為可能［1］。流感具有強傳染性，將其改造成攜帶外源基因的流感病毒載體，有利于轉染到目的細胞，特別是腫瘤細胞，為腫瘤基因治療提供新的手段［2，3］本文利用H9N2亞型禽流感病毒為骨架，參考H9N2的反向遺傳質粒構建方案［4］，構建表達綠色熒光蛋白GFP，更方便的觀察重組病毒在細胞內的復制情況。研究了重組病毒在A549細胞上的生長情況。

1 材料和方法

1.1 毒株、質粒和細胞

H9N2流感病毒的8個基因片段的載體質粒以及PHW2000表達/轉錄載體質粒是由揚州大學傳染病重點實驗室構建并保存。PEGFP-C1質粒購于BD Biosciences 公司。293T和MDCK細胞用含1 0%胎牛血清的D ME M培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

Platinum TaqDNA Polymerase High Fidelity 是Ivitrogen產品。BsmBI是BioLabs產品。PolyFect Transfection Reagent轉染試劑購于Qiagen公司。質粒DNA小量提取試劑盒是Axygen產品，10mL/L雞紅細胞按常規(guī)方法自行制備。

1.3 病毒轉錄/表達載體的構建參考Manissamy、 Hoffmann報道［5，6］以 DNAstar 軟件設計擴增NS1、NEP、PEGFP-C1基因的特異性引物。引物是由南京金斯瑞生物工程技術服務有限公司合成（PAGE純化）。以PHW2000-NS、PEGFP-C1為模板，PCR擴增N S 1、N E P、G F P的目的片段，并用B s m B I酶切目的片段和PHW2000，電泳、回收后，在T4連接酶作用下連接，轉化、挑取單個菌落后擴大培養(yǎng)，小提質粒，送南京金斯瑞公司測序。測序結果比對正確的質粒擴大培養(yǎng)后，無菌提取用于轉染。

1.4 病毒拯救

將293T細胞和MDCK細胞按照2：1的細胞量鋪入6孔板中，待細胞豐度達70-90%時用無抗無血的DMEM洗2次進行轉染。轉染方法參照PolyFectR Transfection Reagent的使用說明書。

1.5 重組病毒的鑒定

收集轉染細胞和上清，接種于9-10日齡SPF雞胚，每胚0.2ml，每個樣品接種3個胚，37℃孵化箱培養(yǎng)96h，收集尿囊液進行鑒定：

1）拯救病毒的血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗：均按照OIE操作標準進行。拯救病毒的尿囊液用1%雞紅細胞進行HA試驗，HA陽性者用H9、H5和形成以（NDV）陽性血清進行HI試驗。

2）重組病毒的基因保真性鑒定：取HA和HI陽性尿囊液提取RNA，用RT-PCR法對各個拯救病毒進行擴增、測序和驗證。

3）病毒的繁殖能力測定：測定雞胚半數(shù)感染量（EID50）將拯救病毒的尿囊液用滅菌的PBS進行10倍連續(xù)稀釋，每個稀釋度接種5枚SPF雞胚，每胚0.2ML，用Reed-Muench法計算。

1.6 重組病毒在A549細胞上的復制情況

按照MOI為0.1和2.0 PFU/cell兩個劑量分別感染1X106cell/ mL 的A549細胞，37℃吸附1h后，棄去培養(yǎng)基，用10%DMEM補上。48h后在倒置顯微鏡下觀察細胞病變情況（CPE）。

1.7 細胞活力分析

按照MOI為0.1和2.0 PFU/cell兩個劑量分別感染1X106cell/ mL 的A549細胞，48h內每隔8h收集一次上清，用MTT實驗檢測細胞的活力。即A549（5000/孔）鋪于96孔板，加入上述上清，PBS洗后加入DMEM培養(yǎng)基和50u/孔的MTT，37℃孵育3h。棄液，每孔加200ul異丙醇，室溫1h后，用ELASA讀數(shù)儀測量在540nm下的OD值。

2 結果與分析

2.1 重組病毒拯救與鑒定

1）病毒拯救：按8質粒轉染系統(tǒng)，將構建的8質粒共轉染293T與MDCK混合細胞，獲得重組病毒。HA試驗表明拯救病毒尿囊液效價為28。用H9、H5亞型禽流感病毒血清陽性血清對其進行HI試驗，結果僅H9陽性血清呈陽性，效價為25。

2）拯救病毒的保真性鑒定：將拯救的重組病毒尿囊液提取RNA，進行RT-PCR擴增各片段并測序，測序結果顯示序列結果一致，NS-GFP已成功構建。

3）獲救病毒雞胚半數(shù)致死劑量（EID50）的測定：參照文獻方法，H9N2亞型流感病毒雞胚半數(shù)感染量（EID50）為10-7/0.2mL。

2.2 重組病毒感染A549后細胞的生長情況

A549在高劑量感染后從16h開始逐漸增長，在24h達到半數(shù)感染量，開始出現(xiàn)細胞變小變形。細胞在低劑量病毒感染下沒有改變。MTT分析顯示A549細胞在MOI 0.1時細胞死亡明顯。

3 討論

溶瘤病毒 （Oncolytic virus ，OV） 是天然或經人工改造的能特異性在腫瘤細胞內大量復制并最終破壞腫瘤細胞，而對正常組織細胞無殺傷作用的一類病毒［7］。流感病毒作為一種新型的溶瘤病毒正在進行深入研究中。目前研究發(fā)現(xiàn)其對腫瘤細胞具有一定的誘導凋亡的作用［8］，如禽流感病毒的NS1蛋白可以通過PKR介導的干擾素途徑誘導細胞凋亡，且具有一定的靶向性［9］。隨著反向遺傳技術的發(fā)展和病毒學的完善，利用基因改造等方法以流感病毒作為載體，攜帶外源基因，增強抗腫瘤免疫反應成為一項新的熱點［10］。本文選擇低致病性的H 9N 2亞型禽流感病毒，通過反向遺傳技術構建表達GFP的重組病毒，直接通過觀察熒光強度更方便的應用于觀察禽流感病毒在腫瘤細胞上的復制情況和腫瘤細胞的死亡情況，為進一步研究流感病毒攜帶外源基因用于抗腫瘤研究提供了新思路。

［1］Neumann G， Kawaoka Y： Reverse genetics of influenza virus. Virology 2001， 287（2）：243-250.

［2］李穎婷， 謝劍鋒， 鄭奎城： 流感病毒反向遺傳技術的研究進展.海峽預防醫(yī)學雜志 2015.

［3］陳帥帥， 沃恩康， 王怡婷， 郭潮潭： 流感病毒介導的抗腫瘤研究進展. 醫(yī)學研究雜志 2014， 第8期：4-6.

［4］Jing B， Chen-Jun LI， Chen HL： Rescue of H9N2 subtype influenza virus by reverse genetics system. Chinese Journal of Veterinary Science 2011.

［5］Hoffmann E， Krauss S， Perez D， Webby R， Webster RG： Eightplasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines. Vaccine 2002， 20（25-26）：3165-3170.

［6］Manicassamy B， Manicassamy S， Belicha-Villanueva A， Pisanelli G， Pulendran B， Garcia-Sastre A： Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2010， 107（25）：11531-11536.

［7］Russell SJ， Peng KW， Bell JC： Oncolytic virotherapy. Nature biotechnology 2012， 30（7）.

［8］Schultz-Cherry S， Dybdahl-Sissoko N， Neumann G， Kawaoka Y，Hinshaw VS： Influenza Virus NS1 Protein Induces Apoptosis in Cultured Cells. Journal of virology 2001， 75（17）：7875-7881.

［9］Engel DA： The influenza virus NS1 protein as a therapeutic target. Antiviral research 2013， 99（3）：409-416.

［10］Murphy A， Westwood JA， Brown LE， Teng MW， Moeller M， Xu Y，Smyth MJ， Hwu P， Darcy PK， Kershaw MH： Antitumor activity of dual-specific T cells and influenza virus. Cancer gene therapy 2007， 14（5）：499-508.

Q2

A

1674-2060（2016）02-0015-02