虎春艷，劉海鷗，趙聲蘭，林玉萍

槲皮素及其兩種配合物清除亞硝酸鈉的活性研究

虎春艷，劉海鷗，趙聲蘭，林玉萍*

（云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500）

采用對(duì)氨基苯磺酸-鹽酸萘乙二胺法測(cè)定了槲皮素、槲皮素-Al及槲皮素-B三種物質(zhì)對(duì)亞硝酸鈉的清除率。結(jié)果表明，槲皮素及其配合物對(duì)亞硝酸鈉具有一定的清除作用，且槲皮素-Al及槲皮素-B配合物對(duì)亞硝酸鈉的清除率明顯高于槲皮素。在最佳反應(yīng)條件下，即質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的清除劑用量1.2 mL，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間30 min，槲皮素對(duì)亞硝酸鈉的清除率為25.8%，而槲皮素-Al和槲皮素-B對(duì)亞硝酸鈉的清除率分別達(dá)到了80.2%和84.1%，且槲皮素-B的清除率稍高于槲皮素-Al。

槲皮素；槲皮素-Al；槲皮素-B；亞硝酸鈉

蔬果和肉制品是人類日常生活中不可或缺的食物。為了保持肉品和腌制蔬菜的顏色，防止在儲(chǔ)存過(guò)程中氧化，抑制肉毒梭狀芽孢桿菌（Clostridium botulinum）等。亞硝酸鹽常作為發(fā)色劑和防腐劑在肉制品加工過(guò)程中使用［1-2］。日常食用的蔬菜、水果及剩菜，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，在細(xì)菌等微生物的作用下，也會(huì)產(chǎn)生亞硝酸鹽［1］。在弱酸性環(huán)境下，亞硝酸鹽與食物中的仲胺、叔胺和酰胺等反應(yīng)可生成強(qiáng)致癌物N-亞硝胺。此外，亞硝酸鹽可使血液中正常攜氧的低鐵血紅蛋白被氧化成高鐵血紅蛋白而引起組織缺氧，嚴(yán)重的可致腦部缺氧［3］。所以，采取清除食物中的亞硝酸鹽、阻斷合成亞硝胺，是有效防止亞硝胺致癌、組織缺氧的有效途徑［1］。某些植物提取物，如荔枝皮色素、大蒜浸提液等物質(zhì)富含黃酮或多酚類化合物，均具有清除亞硝酸鹽的作用［4-6］。

槲皮素（quercetin）廣泛存在于水果、蔬菜和茶葉等植物中，是人類飲食中黃酮類化合物的主要來(lái)源。槲皮素及其衍生物在植物界分布廣泛，是具有多種生物活性的黃酮類化合物，在抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、降血糖等方面表現(xiàn)出較好的生物活性［7-9］。此外，槲皮素與一些金屬離子能形成配合物，其配合物也大多具有良好的生物活性。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外合成的槲皮素配合物已達(dá)到了幾十種，這些配合物大多表現(xiàn)出較好的生物活性，尤其是在抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌等方面表現(xiàn)顯著［10-15］。文獻(xiàn)報(bào)道，槲皮素與鉛離子（Al3+）能生成穩(wěn)定的槲皮素-Al配合物，并能對(duì)牛血清蛋白具有熒光猝滅作用［16］。槲皮素與三氟化硼（BF3）也易形成穩(wěn)定的槲皮素-B配合物。

本試驗(yàn)著重研究了槲皮素及其兩種配合物對(duì)亞硝酸鈉的清除作用，并考察了其反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度及用量對(duì)亞硝酸鈉清除率的影響，以期為槲皮素及其配合物的生物活性研究提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

槲皮素（純度99%）：上海將來(lái)生化試劑有限公司；鹽酸萘乙二胺（分析純）：廣東光華科技股份有限公司；無(wú)水對(duì)氨基苯磺酸（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；無(wú)水三氯化鋁、三氟化硼乙醚溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為47%）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、鹽酸（均為分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì)：日本島津公司；CP214型電子分析天平：奧豪斯儀器有限公司；H.H.S11-4R電熱恒溫水浴鍋：上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療器械五廠。

1.3方法

1.3.1溶液的配制

0.4 mg/mL槲皮素、槲皮素-Al及槲皮素-B溶液的配制：分別準(zhǔn)確稱取20 mg槲皮素、槲皮素-Al及槲皮素-B，用無(wú)水乙醇溶解后，定容至50 mL容量瓶中。

5 μg/mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制：準(zhǔn)確稱取0.050 0 g亞硝酸鈉，用蒸餾水定容至250 mL容量瓶中，得到200 μg/mL亞硝酸鈉儲(chǔ)備液，準(zhǔn)確量取儲(chǔ)備液2.5 mL，用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，備用。

0.2%鹽酸萘乙二胺溶液的配制：精確稱取0.100 0 g鹽酸萘乙二胺，用蒸餾水定容至50 mL容量瓶中，避光保存。

0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液的配制：精確稱取0.400 0 g對(duì)氨基苯磺酸，用體積分?jǐn)?shù)20%鹽酸溶液定容至100 mL容量瓶中，避光保存。

1.3.2配合物的合成

（1）槲皮素-Al配合物的合成

準(zhǔn)確稱取槲皮素200 mg溶于50 mL無(wú)水乙醇中，在不斷攪拌下加入無(wú)水三氯化鋁（AlCl3）88.3 mg，充分?jǐn)嚢? h反應(yīng)完全后，40℃減壓蒸餾，所得黃棕色固體物質(zhì)避光自然揮發(fā)干燥，備用［16］。

（2）槲皮素-B配合物的合成

準(zhǔn)確稱取槲皮素200 mg，加入20 mL三氟化硼（BF3）乙醚溶液，于130℃攪拌加熱回流50 min，得黃褐色溶液，冷卻至室溫，有黃褐色粉末固體析出，過(guò)濾，固體物質(zhì)用無(wú)水乙醚洗滌3次，所得黃褐色固體物質(zhì)避光自然揮發(fā)干燥，備用［17］。

1.3.3槲皮素及其配合物清除亞硝酸鈉的影響因素

研究槲皮素及其配合物在不同反應(yīng)時(shí)間、不同反應(yīng)溫度及不同清除劑用量時(shí)對(duì)亞硝酸鈉的清除效果。反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為10 min、20 min、30 min、40 min和50 min；反應(yīng)溫度設(shè)定為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃；槲皮素及其配合物的用量設(shè)定為0.3 mL、0.6 mL、0.9 mL、1.2 mL、1.5 mL。

1.3.4亞硝酸鈉清除率的測(cè)定

弱酸性條件下，亞硝酸鈉與對(duì)氨基苯磺酸發(fā)生重氮化，再與鹽酸萘乙二胺偶合生成紅色化合物，通過(guò)測(cè)定相同條件下亞硝酸鈉含量的變化，來(lái)反映槲皮素及其配合物對(duì)亞硝酸鈉的清除率［4］。

準(zhǔn)確吸取5 μg/mL的亞硝酸鈉溶液2 mL于25 mL具塞試管中，添加一定量的清除劑，在一定溫度下反應(yīng)一段時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后，立即加入2 mL 0.4%對(duì)氨基苯磺酸，搖勻后靜置5 min，加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，用蒸餾水定容至刻度線，搖勻靜置15 min，在波長(zhǎng)534 nm處測(cè)定吸光度值，平行測(cè)定3次求平均值。亞硝酸鈉清除率計(jì)算公式如下：

式中，A0為未加待測(cè)液時(shí)亞硝酸鈉的吸光度值，A為加入待測(cè)液時(shí)亞硝酸鈉的吸光度值。

2　結(jié)果與分析

2.1槲皮素及其配合物的紫外-可見吸收光譜

圖1　槲皮素及槲皮素-Al和槲皮素-B配合物的紫外-可見吸收光譜Fig.1 Ultraviolet-visible absorption spectrum of quercetin，quercetin-Al and quercetin-B

圖1是槲皮素、槲皮素-Al及槲皮素-B配合物的紫外-可見光譜吸收?qǐng)D。由圖1可知，槲皮素在波長(zhǎng)255 nm和370 nm處有兩個(gè)吸收峰，255 nm吸收帶由苯甲酰生色團(tuán)產(chǎn)生，屬于π→π*電子躍遷；370 nm吸收帶由肉桂酰生色團(tuán)產(chǎn)生，屬于n→π*電子躍遷，其環(huán)上的羥基為酚羥基或烯醇式羥基，容易作為電子供體與Al（III）等金屬配位［18］。

當(dāng)槲皮素與AlCl3和BF3形成配合物后，槲皮素的兩個(gè)吸收峰分別紅移至266 nm和426 nm，說(shuō)明配位后，槲皮素分子的電子結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，分子中的共軛增大，生成了穩(wěn)定配合物，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［16-18］。

2.2不同用量的槲皮素及其配合物對(duì)亞硝酸鈉清除率的影響

考察質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的槲皮素及其配合物的不同用量對(duì)亞硝酸鈉清除率的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，當(dāng)用量為0.3～1.2 mL時(shí)，隨著槲皮素及其配合物用量的增加，亞硝酸鈉的清除率逐漸增大，且槲皮素配合物對(duì)亞硝酸鈉的清除率始終大于槲皮素，這可能是由于配位化合物生成后，增加了酚羥基的活性［10］；當(dāng)用量為1.2 mL時(shí)，槲皮素對(duì)亞硝酸鈉的清除率到達(dá)最大，為24.3%，槲皮素-Al和槲皮素-B對(duì)亞硝酸鈉的清除率也達(dá)到最大，分別為81.9%和83.4%；當(dāng)用量＞1.2 mL以后，增加槲皮素及其配合物的用量，其對(duì)亞硝酸鈉的清除率變化不是太大。因此，選擇槲皮素及其兩種配合物的用量為1.2 mL。

圖2　不同用量的槲皮素及其配合物對(duì)亞硝酸鈉清除率的影響Fig.2 Effect of different addition of quercetin and its complexes on scavenging rate of sodium nitrite

2.3不同反應(yīng)溫度槲皮素及其配合物對(duì)亞硝酸鈉清除率的影響

考察不同反應(yīng)溫度時(shí)，質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL、用量為1.2 mL的槲皮素及其配合物對(duì)亞硝酸鈉清除率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3　不同反應(yīng)溫度槲皮素及其配合物對(duì)亞硝酸鈉清除率的影響Fig.3 Effect of different reaction temperature of quercetin and its complexes on scavenging rate of sodium nitrite

由圖3可知，隨著反應(yīng)溫度的增加，槲皮素對(duì)亞硝酸鈉的清除率呈先增加后下降的趨勢(shì)，而槲皮素配合物對(duì)亞硝酸鈉的清除率呈先增加后趨于平緩的趨勢(shì)。當(dāng)反應(yīng)溫度為50℃時(shí)，槲皮素對(duì)亞硝酸鈉的清除率達(dá)到最大，為24.9%，槲皮素-Al及槲皮素-B配合物對(duì)亞硝酸鈉的清除率明顯上升，分別達(dá)到了74.1%和78.3%；當(dāng)反應(yīng)溫度＞50℃后，槲皮素對(duì)亞硝酸鈉的清除率反而降低，這可能是高溫使槲皮素中的酚羥基穩(wěn)定性降低，因此活性隨之降低；而其兩種配合物對(duì)亞硝酸鈉的清除率變化不大，原因可能是槲皮素分別與Al和B配位后，穩(wěn)定性更好，清除亞硝酸鈉的活性也隨之更好。故選擇最佳反應(yīng)溫度為50℃。

2.4不同反應(yīng)時(shí)間槲皮素及其配合物對(duì)亞硝酸鈉清除率的影響

考察不同反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)溫度為50℃時(shí)，質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL、用量為1.2 mL的槲皮素及其配合物對(duì)亞硝酸鈉清除率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)槲皮素及其配合物對(duì)亞硝酸鈉清除率的影響Fig.4 Effect of different reaction time of quercetin and its complexes on scavenging rate of sodium nitrite

由圖4可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，槲皮素對(duì)亞硝酸鈉的清除率影響較小，在反應(yīng)時(shí)間為10～30min時(shí)，槲皮素-Al及槲皮素-B配合物對(duì)亞硝酸鈉的清除率隨反應(yīng)時(shí)間的增加而增加；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，槲皮素對(duì)亞硝酸鈉的清除率達(dá)到最大，為25.8%，槲皮素-Al和槲皮素-B對(duì)亞硝酸鈉的清除率分別為80.2%和84.1%，之后隨反應(yīng)時(shí)間的增加，其清除率變化較小。故設(shè)定最佳反應(yīng)時(shí)間為30 min。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)研究了槲皮素、槲皮素-Al及槲皮素-B配合物對(duì)亞硝酸鈉的清除效果。結(jié)果表明，槲皮素、槲皮素-Al及槲皮素-B配合物對(duì)亞硝酸鈉有一定的清除作用，且槲皮素-Al及槲皮素-B配合物對(duì)亞硝酸鈉的清除率明顯高于槲皮素。在最佳反應(yīng)條件下，即質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的槲皮素及其配合物用量1.2 mL，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間30 min，槲皮素對(duì)亞硝酸鈉的清除率為25.8%。槲皮素-Al和槲皮素-B配合物的清除率分別達(dá)到了80.2%和84.1%。研究結(jié)果表明，槲皮素與AlCl3和BF3絡(luò)合生成配合物后，對(duì)亞硝酸鈉具有較好的清除活性，為槲皮素及槲皮素配合物生物活性的深入研究提供了參考。

［1］姚駿，陳闖，佟永薇.亞硝酸鹽安全性研究現(xiàn)狀［J］.食品研究與開發(fā)，2015，36（7）：136-139.

［2］劉廣福，王碩，朱興旺，等.接種發(fā)酵和自然發(fā)酵酸菜的亞硝酸鹽含量對(duì)比分析［J］.中國(guó)釀造，2013，32（7）：74-76.

［3］張強(qiáng)，王松華，孫玉.10種香辛調(diào)味料提取物對(duì)亞硝酸鹽清除能力的研究［J］.食品工業(yè)科技，2015，36（17）：100-103.

［4］宋茹，韋榮編，胡金申，等.荔枝皮色素體外清除亞硝酸鹽作用研究［J］.食品科學(xué)，2010，31（5）：104-107.

［5］黃俊生.南姜表皮花青素清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2012，37（2）：243-245.

［6］秦衛(wèi)東，王忠.蘆薈清除亞硝酸鹽的能力及其在肉制品中的作用［J］.食品科技，2005，30（12）：20-23.

［7］LI X M，ZHENG T S，SANG S M，et al.Quercetin inhibits advanced glycation end product formation by trapping methylglyoxal and glyoxal［J］. J Agr Food Chem，2014，62：12152-12158.

［8］SUZGEC-SELCUK S，BIRTEKS A S.Flavonoids ofHelichrysum chasmolycicumand its antioxidant and antimicrobial activities［J］.S Afr J Bot，2011，77（1）：170-174.

［9］王艷芳，王新華，朱宇同.槲皮素藥理作用研究進(jìn)展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012，15（2）：171-173.

［10］郭艷華.第一過(guò)渡金屬對(duì)槲皮素的化學(xué)改性及抗氧化活性［J］.中國(guó)釀造，2013，32（1）：107-109.

［11］CHEN X，TANG L J，SUN Y N，et al.Syntheses，characterization and antitumor activities of transition metal complexes with isoflacone［J］.J Inorg Biochem，2010，104（4）：379-384.

［12］WAND H F，SHEN R，WU J C，et al.Antitumor activity and DNA-binding investigations of the Zn（II）and Cu（II）compleses with isoeuxanthone［J］.Chem Pharm Bull，2009，57（8）：814-818.

［13］ZWANG T J，SINGH K，JOHAL M S，et al.Elucidation of the molecular interaction between cisplatin and flavonol（s）and their effect on dna binding［J］.J Med Chem，2013，56（4）：1491-1498.

［14］ALEXANDRA P，GLORIA M，CHRISTINA L，et al.Understanding zinc（II）chelation with quercetin and luteolin：a combined NMR and theoretical study［J］.J Phys Chem B，2015，119（1）：83-95.

［15］LI Y，YANG Z Y，WANG M F.Synthesis，characterization，DNA binding properties and antioxidant activity of Ln（III）complexes with hesperetin-4-one-（benzoyl）hydrazine［J］.Eur J Med Chem，2009，44（11）：4585-4595.

［16］李慧峰，李萍，李迎，等.槲皮素-鋁配合物合成過(guò)程中紫外-可見時(shí)間分辨吸收光譜［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2008，28（2）：352-355.

［17］KATSUHIKO O，JUNKO H，HIROYUKI Y，et al.Synthesis，crystal structure，and electron-accepting property of the BF2complex of a dihydroxydione with a perfluorotetracene skeleton［J］.Org Lett，2009，11（19）：4326-4329.

［18］林天樂，嚴(yán)寶珍，胡高飛.Al（III）-槲皮素的光譜分析［J］.分析化學(xué)，2006，34（8）：1125-1128.

Activity of quercetin and its two quercetin complexes on sodium nitrite scavenging

HU Chunyan，LIU Haiou，ZHAO Shenglan，LIN Yuping*
（College of Traditional Chinese Medicine，Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China）

The scavenging rate of quercetin，quercetin-Al and quercetin-B on sodium nitrite was determined by aminobenzene sulfonic acid-hydrochloric acid naphthalene ethylenediamine method.The results showed that quercetin and its quercetin complexes had a certain scavenging activity on sodium nitrite.The scavenging rate of quercetin-Al and quercetin-B on sodium nitrite was significantly higher than that of quercetin.Under the optimal reaction conditions of 0.4 mg/ml scavenging agent addition 1.2 mL，reaction temperature 50℃and temperature 30 min，the scavenging rate of quercetin on sodium nitrite was 25.8%，while the scavenging rate of quercetin-Al and quercetin-B on sodium nitrite were 80.2%and 84.1%，respectively.The scavenging rate of quercetin-B was slightly higher than that of quercetin-Al.

quercetin；quercetin-Al；quercetin-B；sodium nitrite

TS201.2

0254-5071（2016）07-0147-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.032

2016-03-01

云南省教育廳項(xiàng)目（2013y239），云南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（2014z119）

虎春艷（1979-），女，講師，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物活性成分及配合物合成。

林玉萍（1975-）女，副教授，碩士，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘钚猿煞帧?/p>