張　保，李立天，張　萌，鄭朋朋，敖新宇

拐棗枝多糖提取工藝優(yōu)化與其抗氧化性研究

張保，李立天，張萌，鄭朋朋，敖新宇*

（西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)院，云南 昆明 650224）

為確定拐棗枝多糖的生物活性，對拐棗枝多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并評(píng)價(jià)其體外抗氧化性強(qiáng)弱，從而為拐棗枝多糖的合理開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。以拐棗枝為試驗(yàn)材料，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化拐棗枝多糖提取工藝；通過拐棗枝多糖對羥自由基（·OH）、ABTS自由基（ABTS+·）和DPPH自由基（DPPH·）的清除率的測定從而評(píng)價(jià)拐棗枝多糖的抗氧化性。結(jié)果表明：最佳多糖的最佳提取條件為料液比1∶30（g∶mL）、浸提溫度80℃、浸提時(shí)間2.0 h，拐棗枝多糖的提取率為2.44%。抗氧化性結(jié)果表明，拐棗枝多糖對·OH、DPPH·和ABTS+·均有較強(qiáng)的清除作用，最大清除率分別達(dá)到76.2%、91.3%和96.8%。

拐棗枝；多糖；響應(yīng)面法；抗氧化性

拐棗（Hovenia acerbaLindl）學(xué)名枳椇，為鼠李科枳椇屬（Rhamnaceaehovenia）。在中國，拐棗分布廣泛，已有研究表明，拐棗果梗中含有豐富的維生素、有機(jī)酸、氨基酸和糖苷以及人體必需的礦物質(zhì)等［1-2］。然而目前關(guān)于拐棗有效成分的提取主要集中在三萜皂苷類［3］、黃酮類［4］、生物堿類［5］、有機(jī)酸類［6］，而對提取拐棗多糖的研究卻相對較少。經(jīng)國內(nèi)外許多的科研工作者研究發(fā)現(xiàn)，多糖在抗腫瘤［7］、抗氧化［8］、抗病毒［9］、免疫調(diào)節(jié)［10-11］、降血糖［12］等方面具有獨(dú)特的藥理活性，因此對拐棗多糖的研究具有重要意義。目前對提取拐棗多糖的研究主要集中在果梗和拐棗子，而對拐棗枝部位的研究較少。于剛等［13］采用不同pH值溶液提取拐棗子多糖，結(jié)果顯示pH值為9.00的碳酸氫鈉溶液提取效果最好且多糖提取率達(dá)到6.61%。鄭朋朋等［14］發(fā)現(xiàn)拐棗枝的乙醇溶液浸提物具有一定的抗氧化性，其效果僅次于拐棗果梗，但未做進(jìn)一步的研究。本試驗(yàn)采用水提醇沉法提取拐棗枝多糖（Hovenia acerbasticks polysaccharides，HASP），響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，并通過對·OH、ABTS+·和DPPH·的清除率的測定從而評(píng)價(jià)拐棗枝多糖的抗氧化性，期望能為拐棗枝多糖的合理開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

拐棗枝：采購于云南省昆明市西南林業(yè)大學(xué)周邊市場，60℃條件下烘箱烘干后，研磨粉粹后過80目篩，備用。

1.1.2化學(xué)試劑

水楊酸、硫酸亞鐵、抗環(huán)血酸、過硫酸鉀（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯仿、正丁醇、乙醇、濃硫酸、苯酚、葡萄糖、30%雙氧水（均為分析純）：汕滇藥業(yè)有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）：美國Sigma公司。

1.2儀器與設(shè)備

M20粉碎機(jī)：德國KIKAWERKE公司；HWS-12水浴鍋、DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；5430R離心機(jī)：德國Eppendorf公司；TU-1901紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FD5-8冷凍干燥器：美國GOLD SIM公司；B490真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；BS224S電子天平：德國SARTORIUS公司。

1.3方法

1.3.1拐棗枝多糖的提取

稱取1.0 g拐棗枝干粉，置于50 mL的離心管中，按照設(shè)定的料液比、浸提時(shí)間和浸提溫度對拐棗枝干粉進(jìn)行水浴浸提；浸提完成后于6 000 r/min的條件下離心10 min，取出后轉(zhuǎn)移上清液并加無水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，4℃靜置沉淀14 h；然后于7 000 r/min的條件下離心5 min，保留沉淀并將多糖沉淀復(fù)溶于蒸餾水中，最后轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中定容待測。

1.3.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確稱取105℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100mg，用蒸餾水溶解后定容至1 L，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精確量取0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，補(bǔ)水至1.0 mL，分別配制成0、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)待測液，加1.0 mL 5%苯酚溶液，混合后再加入3.5 mL濃硫酸，迅速混勻，放置流水中冷卻5 min，然后在波長489 nm處測定吸光度值，以葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3拐棗枝多糖的測定

量取1.0 mL多糖待測液，加1.0 mL 5%苯酚溶液，混合后加入3.5 mL的濃硫酸，迅速混勻，放置流水中冷卻5 min，在波長489 nm處測定吸光度值，并利用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算拐棗枝多糖含量，多糖提取率計(jì)算式如下：

式中：W為多糖提取率，%；C為所得樣品吸光值經(jīng)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算后獲得的樣品多糖質(zhì)量濃度，μg/mL；V為樣品多糖定容后體積，mL；m為拐棗枝樣品質(zhì)量，g。

1.3.4單因素試驗(yàn)

以蒸餾水為浸提溶劑，分別按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL）于浸提溫度65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃條件下提取0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h，每組3次平行試驗(yàn)，以拐棗枝多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間對拐棗枝多糖提取的影響。

1.3.5響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken模型，以浸提溫度（A）、浸提時(shí)間（B）、料液比（C）3個(gè)影響因素作為自變量，以拐棗枝多糖提取率（Y）為響應(yīng)值。并以-1、0、+1分別代表因素水平。響應(yīng)面因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.6拐棗枝多糖樣品的制備

稱取100 g拐棗枝干粉，按響應(yīng)面分析法優(yōu)化的最佳提取工藝條件進(jìn)行浸提，取出后進(jìn)行抽濾，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1.0 L，加無水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，靜置沉淀14 h，然后于7 000 r/min的條件下離心5 min，保留沉淀，真空干燥后得到拐棗枝粗多糖G1；將粗多糖G1復(fù)溶于水中，采用Sevag法［15］去除蛋白，在脫蛋白的多糖溶液中加入無水乙醇，沉淀真空冷凍干燥（-40℃、48 h）得到拐棗枝精多糖G2，-20℃保存待用。

1.3.7拐棗枝多糖的抗氧化性研究

清除·OH能力測定：按照參考文獻(xiàn)［16］的方法進(jìn)行，羥自由基清除效率計(jì)算式如下：

式中：P1為·OH清除率，%；A為不同樣品溶液吸光度值；A′為蒸餾水替代水楊酸的樣品本底吸光度值；A″為蒸餾水替代樣品的對照溶液吸光度值。

清除DPPH·能力測定：按照參考文獻(xiàn)［17］的方法進(jìn)行，DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：P2為DPPH自由基清除率，%；A為不同樣品溶液吸光度值；A′為蒸餾水替代DPPH自由基液的樣品本底吸光度值；A″為蒸餾水替代樣品的對照溶液吸光度值。

清除ABTS+·能力測定：按照參考文獻(xiàn)［18］的方法進(jìn)行，ABTS自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：P3為ABTS自由基清除率，%；A為不同樣品溶液吸光度值；A′為蒸餾水替代ABTS自由基液的樣品本底吸光度值；A″為蒸餾水替代樣品的對照溶液吸光度值。

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用Origin 8.0軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。由圖1可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程：y=0.01032x+0.07486，相關(guān)系數(shù)R2=0.997，在0～100 μg/mL的葡萄糖質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1料液比對拐棗枝多糖提取率的影響

圖2　料液比對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polysaccharides

由圖2可知，料液比在1∶10～1∶40（g∶mL）時(shí)，拐棗枝多糖的提取率隨著料液比的增加而逐漸增大，當(dāng)液料比達(dá)到1∶40（g∶mL）時(shí)，拐棗枝多糖的提取率達(dá)到最大值1.959%；繼續(xù)增加料液比，多糖提取率趨于穩(wěn)定。結(jié)果表明，最佳料液比為1∶40（g∶mL）。

2.2.2浸提時(shí)間對拐棗枝多糖提取率的影響

圖3　浸提時(shí)間對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides

由圖3可知，浸提時(shí)間在0.5～2.0 h時(shí)，拐棗枝多糖的提取率隨著浸提時(shí)間的增加而逐漸增大，當(dāng)浸提時(shí)間達(dá)到2.0 h時(shí)，拐棗枝多糖的提取率達(dá)到最大值2.141%；繼續(xù)增加浸提時(shí)間，多糖提取率不再增加。結(jié)果表明，最佳浸提時(shí)間為2.0 h。

2.2.3浸提溫度對拐棗枝多糖提取率的影響

圖4　浸提溫度對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides

由圖4可知，浸提溫度在65～80℃時(shí)，拐棗枝多糖的提取率隨著浸提溫度的升高而逐漸增大，當(dāng)浸提溫度達(dá)到80℃時(shí)，拐棗枝多糖的提取率達(dá)到最大值2.570%；繼續(xù)增加浸提溫度，多糖提取率不再增加。結(jié)果表明，最佳浸提溫度為80℃。

2.3響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1回歸模型建立與方差分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design Expert 8.0.5軟件中的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中析因點(diǎn)12個(gè)，零點(diǎn)重復(fù)3個(gè)，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3　回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到二次多項(xiàng)式回歸方程：

Y=2.47+0.099A+0.02B-8.625×10-3C+0.027AB-6.5×10-3AC-0.032BC-0.24A2-0.2B2-0.012C2。

由表3方差分析可知，調(diào)整后的決定系數(shù)R2=0.988，表明該模型擬合良好，該回歸模型達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。模型中的A、A2、B2對響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.01），B、AB、BC對響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05），這表明試驗(yàn)因素對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系。失擬項(xiàng)P=0.211 1＞0.05，差異不顯著，表明建立的二次多項(xiàng)式回歸模型可以運(yùn)用于拐棗枝多糖提取優(yōu)化的理論預(yù)測。

2.3.2響應(yīng)面圖分析

各個(gè)影響因子交互作用的響應(yīng)面和等高線分析圖見圖5。由圖5可知，在所選的各影響因素的取值范圍內(nèi)存在極大值，即拐棗枝多糖提取率最大。浸提溫度對拐棗枝多糖提取率的影響極顯著，表現(xiàn)為曲線較陡；浸提時(shí)間對拐棗枝多糖提取率的影響顯著，表現(xiàn)為曲線較緩；料液比對拐棗枝多糖提取率的影響不顯著，表現(xiàn)為曲線平緩。

圖5　浸提溫度、浸提時(shí)間和料液比對多糖提取率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interactions between extraction temperature，time and solid-liquid ratio on extraction rate of polysaccharides

2.3.3最佳提取工藝條件

由Design Expert 8.0.5軟件分析得出：當(dāng)浸提溫度（A）為80.87℃、浸提時(shí)間（B）為2.06 h、料液比（C）為1∶31.34（g∶mL）時(shí)，理論最佳拐棗枝多糖提取率為2.487%?？紤]在實(shí)際操作上的方便性，將各因素修正為浸提溫度80℃、浸提時(shí)間2.0h、料液比1∶30（g∶mL）。然后在修正的各因素條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。通過3次平行試驗(yàn)得到的實(shí)際平均提取率分別為2.327%、2.486%、2.492%，平均提取率為2.435%，與理論值2.487%接近。因此，響應(yīng)面法對拐棗枝多糖浸提條件的優(yōu)化是可行的且具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.4粗多糖的紫外光譜掃描結(jié)果

采用紫外可見分光光度計(jì)，對提取的拐棗枝粗多糖G1、拐棗枝精多糖G2，在800～200 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果見圖6。由圖6可知，粗多糖G1在波長260～280 nm范圍內(nèi)出現(xiàn)紫外吸收峰，此范圍內(nèi)的吸收峰為蛋白質(zhì)吸收峰，表明粗多糖G1是含蛋白質(zhì)的多糖；而經(jīng)過Sevag試劑除蛋白后的精多糖G2在波長260～280 nm范圍內(nèi)未出現(xiàn)紫外吸收峰，表明精多糖G1已經(jīng)去除蛋白質(zhì)，由此可見Sevag法可以有效除去拐棗枝多糖中蛋白質(zhì)。

圖6　拐棗枝多糖紫外吸收光譜掃描結(jié)果Fig.6 UV spectra scan results of polysaccharides

2.5拐棗枝多糖抗氧化性分析

2.5.1清除·OH能力測定結(jié)果

羥基自由基能夠輕易地穿過細(xì)胞膜并與大多數(shù)生物分子（如糖類、脂類、蛋白質(zhì)和DNA等）發(fā)生反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，甚至組織損傷［19-20］。由圖7可知，在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，拐棗枝多糖對·OH清除率呈逐漸上升趨勢，多糖在1～4 mg/mL時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增加，·OH清除率不斷增大，4～5 mg/mL時(shí)多糖對·OH清除作用趨于穩(wěn)定，最大的清除率達(dá)到76.2%。VC在質(zhì)量濃度0.2～1.0 mg/mL時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增加，其對·OH清除率增加迅速，超過1.0 mg/mL后，·OH清除率基本沒有變化，維持在99.1%。結(jié)果表明，拐棗枝多糖對·OH有一定的清除能力，但比VC弱。

圖7　拐棗枝多糖對羥自由基的清除作用Fig.7 Scavenging activity of polysaccharides on hydroxyl radicals

2.5.2清除DPPH·能力測定結(jié)果

圖8　拐棗枝多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.8 Scavenging activity of polysaccharides on DPPH radicals

由于DPPH自由基操作的簡單性和結(jié)果的可重現(xiàn)性，DPPH自由基被廣泛應(yīng)用于各種天然化合物的抗氧化性能力的測定［21］。由圖8可知，在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，拐棗枝多糖對DPPH·清除率呈逐漸上升趨勢，多糖在1～2mg/mL時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增加，DPPH·清除率不斷增大，2～5mg/mL時(shí)多糖對DPPH·清除作用趨于穩(wěn)定，最大的清除率達(dá)到91.3%。VC在質(zhì)量濃度0.02～ 0.10 mg/mL時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增加，其對DPPH·清除率增加迅速，超過0.1mg/mL后，DPPH·清除率基本沒有變化，維持在94.2%。結(jié)果表明，拐棗枝多糖對DPPH·有較好的清除能力，但比VC稍弱。

2.5.3清除ABTS自由基能力測定結(jié)果

通過吸光度值的變化來檢測ABTS自由基的清除率，已經(jīng)成為廣泛用于檢測化學(xué)成分的抗氧化活性的使用方法［22-23］。由圖9可知，在試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，拐棗枝多糖對ABTS+·清除率維持在95%左右，最大的清除率達(dá)到96.8%。VC在質(zhì)量濃度0.01～0.05 mg/mL時(shí)，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，其對ABTS自由基清除率增加迅速，多糖質(zhì)量濃度超過0.05 mg/mL后，ABTS自由基清除率基本沒有變化，維持在98.2%。結(jié)果表明，拐棗枝多糖有較好對ABTS自由基清除能力，但比VC略弱。

圖9　拐棗枝多糖對ABTS自由基的清除作用Fig.9 Scavenging activity of polysaccharides on ABTS radicals

3　結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對拐棗枝多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳提取工藝為：料液比1∶30（g∶mL），浸提時(shí)間2.0 h，浸提溫度80℃，多糖提取率為2.435%，與理論值2.487%接近。因此，響應(yīng)面法對拐棗枝多糖的浸提條件的優(yōu)化是可行的且具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值?？寡趸栽囼?yàn)研究結(jié)果表明，拐棗枝多糖對·OH、DPPH·和ABTS+·具有一定的清除作用，且隨著拐棗枝多糖的質(zhì)量濃度增加而作用增強(qiáng)，最大清除率達(dá)分別到76.2%、91.3%和96.8%。試驗(yàn)結(jié)果表明，拐棗枝多糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可作為天然的抗氧化劑資源進(jìn)行開發(fā)和利用。

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Optimization of extraction technology ofHovenia acerbasticks polysaccharides and its antioxidant activity

ZHANG Bao，LI Litian，ZHANG Meng，ZHENG Pengpeng，AO Xinyu*
（College of Life Science，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China）

To determine the biological activity ofHovenia acerbasticks polysaccharide（HASP），the extraction process condition of HASP was optimized and thein vitroantioxidant activity of HASP was evaluated.On the basis of single factor test，response surface analysis was used to optimize the extraction process of polysaccharides fromH.acerbasticks.The scavenging efficiency of HASP on hydroxyl radical，ABTS radical and DPPH radical were determined，to study the antioxidant activity.The results showed that the optimal extraction conditions were solid-liquid ratio 1∶30（g∶ml），extraction temperature 80℃and time 2.0 h，and the extraction rate of HASP was up to 2.44%.Thein vitroantioxidant activity tests revealed that HASP exhibited high hydroxyl radical，DPPH radical，and ABTS radical scavenging activities，and maximum scavenging rate were 76.2%，91.3% and 96.8%，respectively.

Hovenia acerbasticks；polysaccharide；response surface method；antioxidant activity

R284.2

0254-5071（2016）07-0155-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.034

2016-03-10

云南省優(yōu)勢特色重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)一級(jí)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（50097505）；西南林業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金（15125）

張保（1992-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。

敖新宇（1978-），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。