吳國梁，李 娜

(廣西科技師范學院 體育學院,廣西 來賓 546199)

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抗阻和被動拉伸聯(lián)合訓練對大鼠腓腸肌衛(wèi)星細胞激活相關因子基因表達的影響*

吳國梁，李 娜

(廣西科技師范學院 體育學院,廣西 來賓 546199)

目的：通過大鼠運動實驗模型，觀察抗阻和被動拉伸訓練后大鼠腓腸肌HGF、MGF及其基因表達的變化，研究被動拉伸和抗阻聯(lián)合訓練對骨骼肌衛(wèi)星細胞激活和增殖的影響；方法：32只成年健康SD大鼠隨機分為4組，對照組(N組，n=8)、被動拉伸組(S組，n=8)、抗阻組(R組，n=8)和混合組(C組，n=8)。N組不做任何處理，對S組和C組大鼠右側腓腸肌手動進行被動拉伸訓練，每分鐘15次，每次維持2s，每天15min，每周4次，共10周。對R組和C組進行尾部負重爬梯訓練，負重為體重的200%，每周3天，每天2組，每組3次，共10周。訓練結束后取右側腓腸肌，測定腓腸肌濕重，ELISA法測定MGF，HGF，RT-PCR測定MGF、HGF的基因表達。結果：訓練組實驗后各項指標均有顯著上升，其中聯(lián)合訓練組各項指標上升最為明顯，與N組比較差異非常顯著(P<0.01)，與R組相比較除HGF外其余指標也差異顯著，但HGF mRNA較S組卻無明顯差異；S組各項指標雖也有顯著上升，但較R組上升幅度要低，且差異非常顯著；結論：被動拉伸訓練和抗阻訓練都可以有效上調，HGF、MGF及其mRNA的表達，進而激活肌衛(wèi)星細胞進入細胞周期分裂增殖，且兩種訓練對衛(wèi)星細胞激活的效果可以疊加。

被動拉伸，抗阻訓練，聯(lián)合訓練，HGF，MGF

肌衛(wèi)星細胞(Satellite cell，SC)是存在于肌膜和基底膜之間的一種未分化的成肌細胞，與受損肌纖維的修復和再生密切相關[1]。通常肌衛(wèi)星細胞處于靜息狀態(tài)，在受到外界刺激時，如損傷、牽拉或者肌肉萎縮病變等，衛(wèi)星細胞能夠被激活進入細胞分裂周期，從而實現(xiàn)對肌纖維的修復、肥大或再生，而衛(wèi)星細胞激活的數(shù)量與肌肉肥大或對損傷修復的速度密切相關[2]。研究證實，肝細胞生長因子(HGF)、機械生長因子(MGF)等關鍵調節(jié)因子在衛(wèi)星細胞的激活和增殖過程中起著重要的調節(jié)作用[3]。一般認為抗阻訓練可以有效激活骨骼肌中衛(wèi)星細胞，在維持骨骼肌衛(wèi)星細胞池的數(shù)量和促進骨骼肌肥大中具有顯著意義。近來也有研究發(fā)現(xiàn)被動拉伸也可以有效提高衛(wèi)星細胞數(shù)量，促進骨骼肌的增長和肥大[4]。本研究對 SD 大鼠進行負重爬梯和被動拉伸兩種方式的訓練，對腓腸肌HGF、MGF的含量及其基因表達進行對比，探討促進衛(wèi)星細胞激活和增殖的有效途徑，為制訂運動員休訓期肌肉狀態(tài)的保持、長年臥床疾病患者和老年性肌萎縮的康復訓練方案提供依據。

1 材料和方案

1.1 實驗動物和分組

清潔級8周齡健康成年SD大鼠32只,體重180g～200g。實驗動物由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。分籠飼養(yǎng)，每個鼠籠2只，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。環(huán)境溫度保持在22℃ ± 2℃ ，濕度40%～ 60%，自然光照。適應性飼養(yǎng)2周后隨機分為對照組(N組，n=8)、被動拉伸組(S組，n=8)、抗阻組(R組，n=8)和聯(lián)合組(C組，n=8)。對S組的右后腿腓腸肌進行手動伸展訓練，對R組進行負重抗阻訓練，對C組進行負重抗阻訓練后再對其右后腿進行手動伸展訓練。

1.2 抗阻和拉伸訓練方案

抗阻訓練采用尾部負重爬梯法進行。爬梯高1m，梯階2cm，傾斜角85°。采用食物誘惑法適應性訓練2周，熟練后開始正式訓練。初始負荷為大鼠體重的30%，以后每周遞增25%，直至體重的200%，一直維持到訓練結束?？棺栌柧毭恐苡柧?天，在每周的一、三、五進行，每天2組，每組3次，共10周。次間休息1min，組間休息2min。

將S組和C組大鼠按40 mg/kg體重用戊巴比妥鈉腹腔麻痹后，對其右后腿都進行踝關節(jié)的被動背屈，適中力度拉伸腓腸肌，每分鐘15次，每次維持2s，每天15min，每周4次，在每周的二、四、六、日進行，共10周。其中C組大鼠的拉伸練習在抗阻訓練后進行。

1.3 選取標本

最后一次訓練完成后24h將大鼠斷頭處死，分離右后腿腓腸肌，生理鹽水清洗稱重后用錫紙包裹放入液氮內保存待測。

1.4 指標的測定

1.4.1 腓腸肌組織MGF、HGF 含量的測定

取腓腸肌約 0.2 g用眼科剪剪碎后按1∶9 的比例加入冰生理鹽水，置入玻璃勻漿器中研磨6min～8min抽取勻漿。取部分勻漿液以 3000 r/min 轉速離心 10 min，提取上清液，即為 10%的組織勻漿液。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定MGF，HGF的含量，具體操作按試劑盒說明書進行。試劑盒由上海喬羽生物科技有限公司提供。

1.4.2 RT-PCR測定MGF、HGF、IGF-ⅠEa基因表達水平

Trizol法提取RNA樣本，按照說明書進行操作。逆轉錄反應體系共20μL，包含 DEPC水6μL，RNA酶抑制劑(50U/uL)0.5μL，隨機引物(50pM/uL)2μL，RNA 2μL，RNA酶抑制劑(50U/uL)0.5μL，5×bueffr 4μL，dNTP MIX 2μL，DTT 2μL，M-MLV(200Uu/L) 1μL。從Genbank查找大鼠MGF mRNA和HGF mRNA全基因序列及引物并由北京安必奇生物科技有限公司合成(見表1)，以GADPH為“管家基因”進行PCR擴增。取15μL PCR擴增產物用goldenview染色，在100伏電壓下用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳40min，然后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結果，用Imgaer TM 2200分析軟件檢測基因表達量OD值，并以GADPH的檢測值為基準計算標本的相對基因表達量。

表1 實驗中各引物序列

注：以上引物序列查自美國國立生物技術信息中心(NCBI)數(shù)據庫GenBank。

1.5 統(tǒng)計分析

本研究所有結果均用SPSS18.0進行處理，數(shù)值用均數(shù)±標準差表示，組間比較用單因素方差分析，顯著性水平取P<0.05，非常顯著取P<0.01。

2 研究結果

2.1 腓腸肌濕重與體重

表2 實驗后各組大鼠腓腸肌濕重和體重比

注：與N組比較，*p<0.05，** p<0.01；與S組比較，#p<0.05，## p<0.01。

由表2，腓腸肌濕重各實驗組較對照組有所升高，其中C組最高，R組次之，S、R、C組與N組相比較均差異非常顯著，R、C組與S組比較差異也非常顯著，但R組與C組間差異不顯著；腓腸肌與體重比S組與N組無顯著差異，R、C組較S、N組稍高，其中與N組差異非常顯著，與S組差異顯著，但R組與C組間差異不顯著。

2.2 實驗后各組腓腸肌 MGF、HGF水平比較

表3 各組腓腸肌HGF、MGF水平比較(pg/mg prot)

注：與N組比較，*p<0.05，** p<0.01；與S組比較，#p<0.05，## p<0.01；與R組比較，☆p<0.05，☆☆p<0.01。

對各組樣本MGF、HGF水平進行測定后，可得表3?？梢?，MGF水平訓練組顯著高于對照組，與N組相比較，S組存在顯著差異，R組和C組存在非常顯著差異，與S組相比較，R組和C組存在非常顯著差異，但R組和C組間無顯著差異；HGF水平訓練組顯著高于對照組，與N組相比較，S組和C組存在顯著性差異，R組存在非常顯著性差異，與S組相比較，R組差異非常顯著，C組差異顯著，R組與C組差異顯著。

2.3 各組腓腸肌MGF、HGF、IGF-ⅠEa mRNA表達水平比較

表4 各組腓腸肌HGF mRNA、MGF mRNA表達水平比較

注：與N組比較，*p<0.05，** p<0.01；與S組比較，#p<0.05，## p<0.01；與R組比較，☆p<0.05。

對各組樣本MGF、HGF mRNA進行測定后，可得表4。由表4，MGF mRNA表達水平S組、R組、C組高于N組，且差異非常顯著，其中R組平均水平最高，R組和C組與S組相比較也存在非常顯著性差異，但R組和C組間無顯著差異；HGF mRNA表達水平S組、R組、C組高于N組，且差異非常顯著，其中C組平均水平最高，R組高于S組，組間相比較差異非常顯著，C組和R、S組間差異顯著，但M組和S組比較差異不明顯。

3 討論

肝細胞生長因子(HGF)是一種由多種細胞分泌的、能刺激多種類型細胞分化增殖再生、運動和遷移的多功能細胞因子，是激活肌衛(wèi)星細胞的關鍵調節(jié)子，肌肉發(fā)育和再生的早期都可以檢測到HGF的表達[5]。衛(wèi)星細胞或骨骼肌受到機械牽拉時，HGF將快速從其儲存部位快速釋放，并與衛(wèi)星細胞表面的HGF 受體(c-met) 相結合，進而激活衛(wèi)星細胞[6]。機械生長因子(MGF)是一種對機械牽拉敏感的局部自分泌性生長因子，受機械刺激和組織損傷時表達，可以激活衛(wèi)星細胞，增加成肌細胞的增殖能力[7]。可見， HGF和MGF及其mRNA的表達水平在一定程度上也反映了骨骼肌衛(wèi)星細胞的激活和增殖程度。

過去較多研究認為運動訓練可以提高局部肌組織HGF、MGF及其基因表達，促進肌衛(wèi)星細胞的增殖和分化，但對于運動強度和形式與肌衛(wèi)星細胞激活之間的關系尚未完全明確。如張山佳等(2010)發(fā)現(xiàn)大鼠負重游泳訓練可以明顯上調骨骼肌MGF mRNA表達，促進骨骼肌的肥大，但所采用的負荷相對較小[8]。葉雷雷(2012)在實驗中觀察到中等強度下坡跑漸增負荷力竭運動后48h大鼠肌組織HGF含量持續(xù)上升，變化非常顯著，認為離心運動可明顯提升HGF在肌組織的表達，對肌組織的修復和肥大有較明顯的促進作用[9]。潘同斌等(2012)則觀察到大負荷力竭運動后大鼠腓腸肌MGF表達顯著上升，且在24h可達峰值，認為大負荷訓練使MGF表達上調，并與骨骼肌損傷的修復密切相關[10]。王靜等(2011)在實驗中觀察到10周大強度負重爬梯力量訓練可顯著上調骨骼肌MGF mRNA表達，引起骨骼肌的肥大[11]。這些研究結果都顯示運動訓練對肌衛(wèi)星細胞的有效激活，但在運動強度和運動方式上并沒有進行橫向對比。為了進一步明確運動強度與衛(wèi)星細胞激活的關系，陳濤等(2011)通過實驗對力量訓練和耐力訓練進行對比后，認為兩種訓練都可使小鼠脛前肌HGF mRNA表達明顯上調，其中力量訓練的表現(xiàn)更加明顯，但兩種訓練方式綜合使用后效果并不疊加[1]。而陳彩珍等(2014)對大鼠進行抗阻力量訓練和耐力訓練，對比后發(fā)現(xiàn)抗阻力量訓練組大鼠腓腸肌濕重和肌纖維橫截面積增加明顯，而耐力組變化不明顯，兩種訓練方式MGF mRNA表達均有上升，其中力量訓練組上升更加顯著[12]?？梢娍棺枇α坑柧毾噍^中等強度耐力訓練對HGF、MGF mRNA表達的提升和肌衛(wèi)星細胞的激活更顯著。由表2，本研究中R組和C組腓腸肌濕重最大，與S組也存在顯著性差異，但在體重中所占的比例的增加并不明顯。這可能是經過抗阻訓練，不但腓腸肌的重量有所增加，而且大鼠的體重也有相應的增加所導致。另由表3、表4，本研究中R組抗阻力量訓練的結果與相關研究相似，抗阻訓練明顯上調大鼠腓腸肌HGF、MGF及mRNA表達(P<0.01)，并進而促進肌肉肥大和肌重量的顯著提升。

另一方面，有些研究中觀察到對于骨骼肌的機械刺激，離心的方式較向心的方式更有利于激活肌衛(wèi)星細胞。如Imaoka Y等(2015)對研究對象的左右腿股外側肌分別進行向心收縮訓練和離心收縮訓練，結果發(fā)現(xiàn)與向心收縮訓練相比較，離心收縮訓練后的Ⅱa型肌纖維顯著增加，HGF mRNA顯著上調[13]。此外，Y. Kamikawa等(2013)在對小鼠腓腸肌被動拉伸的實驗中觀察到，重復性拉伸和持續(xù)性拉伸都可以促進腓腸肌的肥大，其中重復性拉伸更加顯著。這提示我們機械刺激對肌衛(wèi)星細胞的激活可能主要作用于肌肉的拉長過程，但他們并未對被動拉伸和主動收縮進行對比。為了驗證被動拉伸對肌衛(wèi)星細胞的激活，本研究對鼠腓腸肌分別進行被動拉伸和抗阻收縮訓練。結果如表3、表4，單純的被動拉伸訓練后大鼠腓腸肌重量明顯上升，肌組織HGF、MGF及其 mRNA表達同樣顯著上升，但上升的幅度較抗阻性力量訓練稍低，而被動拉伸和抗阻混合訓練組肌組織HGF、MGF及其 mRNA表達的上升最為明顯，其幅度甚至超過單純的抗阻訓練。可見，被動拉伸練習可以通過上調HGF、MGF mRNA的表達增加HGF、MGF的復制并進而激活肌衛(wèi)星細胞，且與抗阻性力量訓練可以效果疊加。但有意思的是C組HGF mRNA表達的上調較S組卻無顯著差異，其原因尚需進一步研究。另外，也有人發(fā)現(xiàn)絕經期婦女拉伸練習后MGF并無明顯改變[14]，但這也可能研究對象及拉伸的方式和劑量有關?？梢酝茢啵粍永煊柧氁部梢源龠M肌衛(wèi)星細胞的激活和增殖，且與抗阻訓練配合使用效果更佳。但在被動拉伸時所采取的強度、幅度及頻率對于不同的對象可能存在較大的個體差異，其之間的關系尚需做進一步的研究。

4 結論

被動拉伸訓練和抗阻訓練都可以有效上調，HGF、MGF及其mRNA的表達，進而激活肌衛(wèi)星細胞進入細胞周期分裂增殖。被動拉伸訓練和抗阻訓練對衛(wèi)星細胞激活的效果可以疊加。這也提示我們，對于無法進行自主抗阻訓練的患者可以采用被動拉伸的方法幫助其肌肉狀態(tài)的保持和恢復。

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Effects of Combination of passive Stretching and Resistance Exercise on HGF and MGF mRNA of Rat's Gastrocnemius

WU Guo-liang,LI Na

(Department of PE, Guangxi Science & Technology Normal University,Laibin 546199, China)

Objective: To investigate the effect of the combination of passive stretching and resistance exercise on the activation of skeletal muscle satellite cell, through examine the expression of HGF、MGF mRNA of rat's gastrocnemius. Methods: 32 adult SD rats were randomly divided into 4 groups: control group(group C,n=8),nothing were done; stretch group (group S,n=8), animals right gastrocnemius muscle was stretched repetitively for 2 seconds/time,15 times/min, 15min daily and 4 times/week under anesthesia; resistance group (group R, n=8), animals underwent 10 weeks(3 times/set, 2sets/day, 3days/week) climbing ladder training with weights (as 200% of their body weights) attached to the rats tails ；combination group(group C, n=8), animals underwent both stretching and resistance trains for 10 weeks. After training, animal's the right gastrocnemius were token respectively. The protein HGF、MGF were detected by the ELISA, RT-PCR was applied to detect the expression of HGF mRNA and MGF mRNA in gastrocnemius muscle. Results: After the combination of passive stretching and resistance exercise ,the weight of gastrocnemius muscle, the expression of HGF,MGF and mRNA was higher in group S,R,C than the group N(P<0.05).Compare to the group N, the expression of HGF,MGF and their mRNA was most in the group C (P<0.01).Compare to group R, the expression of HGF mRNA, MGF mRNA and MGF was high significant differences(P<0.05).But compare to the group S, the expression of HGF mRNA of the group C was not significant differences; Compare to the group R, the expression of HGF,MGF and their mRNA was high significant differences in group S. Conclusion: Both passive stretching and resistance exercise can effectively improve the expression level of the HGF,MGF and their mRNA, and activate the satellite ecll into the cell cycle to differentiation and proliferation. And the effect of them can be accumulated.

passive stretching；resistance exercise；comination; satellite cell; activation

2016-09-26

吳國梁(1976-)，男，山東鄆城人，講師，碩士 通訊作者：李娜(1979)，女，山東鄆城人，講師，碩士

廣西高校中青年教師基礎能力提升項目(KY2016YB551)

G804

A

1007-323X(2016)06-0104-04

研究方向：運動損傷的預防與康復