汪東劍，余維濤，劉冬萍，張曉云，邱華琴，劉 仙

(中國人民解放軍第一八四醫(yī)院輸血科，江西鷹潭 335000)

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·論 著·

不同乳汁成分乙型肝炎病毒DNA定量檢測(cè)的結(jié)果分析*

汪東劍，余維濤Δ，劉冬萍，張曉云，邱華琴，劉 仙

(中國人民解放軍第一八四醫(yī)院輸血科，江西鷹潭 335000)

目的 分析不同乳汁成分中乙型肝炎病毒(HBV)-DNA定量檢測(cè)的結(jié)果，為乳汁標(biāo)本HBV-DNA檢測(cè)提供參考和依據(jù)。方法 對(duì)152例乙肝產(chǎn)婦乳汁分別選用混勻乳汁、乳酪、乳清和沉淀進(jìn)行HBV-DNA定量檢測(cè)。結(jié)果 選用不同的檢測(cè)對(duì)象時(shí)，HBV-DNA檢測(cè)的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.437，P=0.933)；HBV-DNA載量間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.835，P=0.043)，沉淀中HBV-DNA載量高于乳清中HBV-DNA載量；兩兩比較后，混勻乳汁、乳酪、乳清間檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，混勻乳汁、乳酪、沉淀間檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 對(duì)乳汁標(biāo)本進(jìn)行HBV-DNA定量檢測(cè)時(shí)，混勻乳汁可能是更為適合的檢測(cè)對(duì)象。

乳汁； 乙型肝炎病毒； DNA

乙型肝炎病毒(HBV)可以通過血液、唾液、乳汁等傳播，母嬰傳播是HBV傳播的重要途徑。利用血清HBV-DNA定量檢測(cè)體系對(duì)乳汁標(biāo)本HBV-DNA進(jìn)行檢測(cè)已經(jīng)廣泛用于臨床和試驗(yàn)研究[1-3]。乳汁是一種較為特殊的體液，經(jīng)過自然沉淀或離心后形成以乳酪、乳清和沉淀為主的3種成分，在乳汁HBV-DNA檢測(cè)中，不同的學(xué)者所選取乳汁成分各不相同，多以乳清或者沉淀為對(duì)象進(jìn)行檢測(cè)[4-6]。目前尚少見使用不同乳汁成分進(jìn)行HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果一致性方面的報(bào)道，故對(duì)于不同學(xué)者間的研究成果是否具有可比性存在疑慮。作者在將高載量HBV-DNA陽性定值血清摻入陰性乳汁建立的自制HBV-DNA陽性乳汁模型中發(fā)現(xiàn)，同一樣品不同乳汁成分中檢測(cè)出的HBV-DNA載量并不一致[7]。由于該模型中HBV-DNA是外來摻入乳汁中，與真實(shí)乳汁中HBV-DNA的存在形式和分布情況可能存在差異，為此本文對(duì)152例產(chǎn)婦乳汁標(biāo)本選用不同成分作為研究對(duì)象進(jìn)行HBV-DNA定量檢測(cè)，通過比較和分析檢測(cè)結(jié)果，試圖發(fā)現(xiàn)不同乳汁成分HBV-DNA檢測(cè)規(guī)律，為臨床和科研工作中選用適當(dāng)?shù)娜橹煞诌M(jìn)行HBV-DNA檢測(cè)提供依據(jù)和參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年10月至2015年12月于本院婦產(chǎn)科分娩，根據(jù)2000年全國病毒性肝炎學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的《病毒肝炎防治方案》診斷標(biāo)準(zhǔn)確診的152例乙肝產(chǎn)婦，年齡18～39歲，平均(26.07±4.81)歲。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理 產(chǎn)后待初乳分泌后，無菌操作采集3～4 mL乳汁于無菌干燥試管密封后-20 ℃保存待檢。

1.2.2 乳汁不同成分的HBV-DNA檢測(cè) 將收集到的待檢乳汁標(biāo)本按檢測(cè)對(duì)象不同分為混勻乳汁組、乳酪組、乳清組、沉淀組，各組HBV-DNA載量檢測(cè)按以下方法進(jìn)行：(1)以混勻乳汁作為檢測(cè)對(duì)象：將乳汁標(biāo)本充分混勻后，取乳汁200 μL，加入450 μL DNA提取液和4 μL內(nèi)標(biāo)溶液，震蕩混勻15 s，瞬時(shí)離心數(shù)秒后，于100 ℃干式恒溫器處理10 min，12 000 r/min離心5 min備用；取上清液20 μL加入HBV-PCR反應(yīng)管12 000 r/min離心數(shù)秒后上機(jī)擴(kuò)增。(2)以乳酪、乳清、沉淀作為檢測(cè)對(duì)象：將乳汁標(biāo)本3 000 r/min離心10 min，分別取乳酪層、中間乳清層、底部沉淀各200 μL，加入450 μL DNA提取液和4 μL內(nèi)標(biāo)溶液，震蕩混勻15 s，瞬時(shí)離心數(shù)秒后，于100 ℃干式恒溫器處理10 min；12 000 r/min離心5 min備用；取上清液20 μL加入HBV-PCR反應(yīng)管12 000 r/min離心數(shù)秒后上機(jī)擴(kuò)增。(3)結(jié)果分析按試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.3 儀器與試劑 HBV-DNA核酸定量檢測(cè)使用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的DA-7600核酸擴(kuò)增儀及其配套HBV-DNA核酸定量檢測(cè)試劑盒。

2 結(jié) 果

2.1 不同乳汁成分HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果 152例乙肝產(chǎn)婦乳汁HBV-DNA檢測(cè)陽性率見表1，不同乳汁成分HBV-DNA檢測(cè)陽性率間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.437，P=0.933)。所有乳汁成分HBV-DNA檢測(cè)均為陽性者共22例，其不同成分HBV-DNA載量檢測(cè)結(jié)果見表1。對(duì)4種乳汁成分HBV-DNA載量結(jié)果進(jìn)行方差檢驗(yàn)，結(jié)果顯示4種乳汁成分中HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.835，P=0.043)。

表1 乳汁不同成分HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果

注：*表示所有成分HBV-DNA檢測(cè)均為陽性的22例乳汁標(biāo)本。

2.2 乳汁HBV-DNA載量分布情況 乳汁標(biāo)本中，不同成分HBV-DNA載量分布情況見表2，比較不同乳汁成分中HBV-DNA載量的分布情況發(fā)現(xiàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.499，P=0.204)。

表2 乳汁HBV-DNA載量分布情況[n(%)]

3 討 論

由于HBV-DNA定量檢測(cè)試劑盒說明書中，并未對(duì)乳汁標(biāo)本的檢測(cè)事項(xiàng)進(jìn)行說明，雖然在《實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)》中對(duì)于乳汁中布魯菌和分枝桿菌DNA的提取分別選用乳汁整體和重懸后的沉淀作為對(duì)象[8]，但也未明確乳汁中HBV-DNA的提取方法，這使得多數(shù)學(xué)者在對(duì)乳汁標(biāo)本進(jìn)行HBV-DNA檢測(cè)時(shí)，對(duì)選擇檢測(cè)對(duì)象缺乏有效的參考，也有不少學(xué)者嘗試對(duì)乳汁標(biāo)本進(jìn)行前處理使其更適用于血清HBV-DNA檢測(cè)體系[9-10]。乳汁分泌后作為一種渾濁非勻質(zhì)液體，需要檢測(cè)的是能代表其整體的HBV-DNA載量，本文之所以對(duì)乳汁進(jìn)行離心選用乳清或者沉淀作為檢測(cè)對(duì)象，多數(shù)是基于提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和陽性率的考慮。

在本研究中，使用混勻乳汁、乳酪、乳清、沉淀作為檢測(cè)對(duì)象時(shí)，HBV-DNA檢測(cè)的陽性率間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.437，P=0.933)，乳汁中不同成分HBV-DNA載量的分布情況間的差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.499，P=0.204)。陽性乳汁中檢測(cè)出的HBV-DNA載量分布在102～106IU/mL；但在乳清與沉淀中HBV-DNA載量的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.234，P=0.007)：乳清中HBV-DNA載量主要分布在102～104IU/mL，沉淀中HBV-DNA載量主要分布在104～106IU/mL。

通過對(duì)4種乳汁成分HBV-DNA載量進(jìn)行方差分析，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.835，P=0.043)。為確定哪些成分的檢測(cè)結(jié)果不同，本文繼而進(jìn)行SNK檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：(1)混勻乳汁、乳酪、乳清間的檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；(2)混勻乳汁、乳酪、沉淀間的檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；(3)乳清與沉淀間的檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，沉淀檢測(cè)結(jié)果高于乳清檢測(cè)結(jié)果。造成這一現(xiàn)象的原因考慮是因?yàn)槿橹蠬BV-DNA主要以游離或物理吸附的形式存在于乳汁懸液和脂肪顆粒、沉淀物表面，通過離心病毒顆粒更多地吸附于沉淀或者脂肪顆粒表面，從而使得乳清中病毒顆粒的載量小于等體積沉淀中的載量；而這種物理吸附導(dǎo)致的差異幅度較小，使得乳清與混勻乳汁、沉淀與混勻乳汁中的HBV-DNA載量間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。從定量檢測(cè)結(jié)果和陽性率來看，混勻乳汁與乳清、混勻乳汁與沉淀間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而其更能代表乳汁整體的情況，并且以乳汁整體作為檢測(cè)對(duì)象已被用作布魯菌中HBV-DNA檢測(cè)的經(jīng)典方法，因此考慮是否將混勻乳汁作為乳汁標(biāo)本HBV-DNA檢測(cè)的對(duì)象更為合適。

實(shí)際上乳汁經(jīng)離心或靜置后形成乳酪、乳清、沉淀三層，這三層并非由單一的組分組成，本文將上述三層分別轉(zhuǎn)移至新的離心管后再次離心發(fā)現(xiàn)依然會(huì)形成乳酪、乳清和沉淀三層，說明簡單的離心并不能將乳汁中的乳酪、乳清、沉淀嚴(yán)格地區(qū)分出來。以乳清作為檢測(cè)對(duì)象的優(yōu)勢(shì)在于缺少了大多數(shù)脂肪顆粒和沉淀的影響，更接近于血清的物理形態(tài)，可能減少脂類、大顆粒物質(zhì)對(duì)HBV-DNA提取和擴(kuò)增的抑制作用。但在研究中發(fā)現(xiàn)，乳清中HBV-DNA的檢測(cè)結(jié)果、陽性率與混勻乳汁間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明乳清并不比混勻乳汁作為檢測(cè)對(duì)象有明顯優(yōu)勢(shì)。以沉淀作為檢測(cè)對(duì)象主要是參考分枝桿菌中HBV-DNA提取方法，期望通過離心能使得乳汁中HBV-DNA主要富集在沉淀中，從而提高檢測(cè)的陽性率。然而本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過離心后，沉淀中HBV-DNA檢測(cè)的陽性率并不高于混勻乳汁，定量檢測(cè)結(jié)果與混勻乳汁間的差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以乳酪作為檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行HBV-DNA檢測(cè)很少見于報(bào)道，絕大多數(shù)學(xué)者都是采用棄上層脂質(zhì)，取乳清/沉淀進(jìn)行HBV-DNA檢測(cè)，這是基于大家普遍認(rèn)為乳酪中的大量的脂類將會(huì)對(duì)HBV-DNA檢測(cè)造成較為明顯的抑制作用。在本研究中卻發(fā)現(xiàn)，乳酪中不僅能夠檢測(cè)出HBV-DNA，而且與其他乳汁成分相比HBV-DNA檢測(cè)陽性率、檢測(cè)結(jié)果間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不過，依然不建議將乳酪作為HBV-DNA的檢測(cè)對(duì)象，因?yàn)椋?1)乳酪容易吸附在微量吸嘴內(nèi)壁及外壁，使得其存在加樣不準(zhǔn)確的可能，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性；(2)吸取乳酪時(shí)難免會(huì)混入部分乳清，使得檢測(cè)結(jié)果并不能完全代表乳酪中HBV-DNA的載量情況。本文建議將混勻乳汁作為乳汁中HBV-DNA檢測(cè)對(duì)象基于以下考慮：(1)方法簡單，無需離心或者自然沉淀的過程；(2)將乳汁成分可能對(duì)HBV-DNA檢測(cè)的影響均勻分?jǐn)?，使其檢測(cè)結(jié)果與真值間的差異不會(huì)過大；(3)盡量使HBV-DNA在乳汁中分布均勻，從而使得檢測(cè)結(jié)果更能代表乳汁中HBV-DNA載量的真實(shí)情況；(4)加樣準(zhǔn)確，不易因加樣誤差而影響檢測(cè)結(jié)果。

乳汁標(biāo)本中HBV-DNA定量檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)化還有許多問題需要解決。本次研究的結(jié)果僅能反映出乳汁中不同成分HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果間的差異，由于缺乏專用的乳汁HBV-DNA檢測(cè)質(zhì)控品，使得對(duì)于檢測(cè)出的不同乳汁部分中HBV-DNA結(jié)果的準(zhǔn)確性缺乏判斷依據(jù)。同時(shí)，由于本次研究中HBV-DNA陽性乳汁例數(shù)較少，乳汁中不同成分HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果的差異仍需要通過更多標(biāo)本的檢測(cè)、更完善的試驗(yàn)設(shè)計(jì)來探討和研究。

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Analysis of hepatitis B virus DNA quantitative detection results in different breast milk compositions*

WANGDongjian,YUWeitaoΔ,LIUDongping,ZHANGXiaoyun,QIUHuaqin,LIUXian

(DepartmentofBloodTransfusion,184HospitalofPLA,Yingtan,Jiangxi335000,China)

Objective To analyze the results of hepatitis B virus(HBV)-DNA quantitative detection in different breast milk components to provide reference and basis for the HBV-DNA quantitative detection of breast milk sample.Methods The HBV-DNA in the blending milk,cheese,whey and precipitation in 152 hepatitis B parturients was quantitatively detected.Results When choosing different detect objects,there was no statistically significant difference in HBV-DNA detection positive rate(χ2=0.437，P=0.933)；the difference in HBV-DNA loads was statistically significant(F=2.835,P=2.835),the HBV-DNA loads in precipitation was higher than that in whey.There was no statistical significant difference in the pairwise comparison of the test results of blending milk,cheese and whey;also the difference of test results among blending milk,cheese and precipitation was not statistically significant(P>0.05).Conclusion In the HBV-DNA quantitative detection of breast milk sample,the blending milk may be more suitable detection object.

breast milk; hepatitis B virus; DNA

南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新課題資助項(xiàng)目(MS078)。

汪東劍，男，副主任技師，主要從事臨床檢驗(yàn)與輸血研究?！?/p>

，E-mail:dearwdj@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.007

A

1673-4130(2016)24-3403-03

2016-09-05

2016-10-24)